張定勇，孫蕾，楊利敏，劉文軍

中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室 中國科學院微生物研究所分子病毒中心，北京 100101

抗菌肽通常是由小于 50個氨基酸的氨基酸殘基組成的具有重要生物學活性的小分子多肽，是生物先天性免疫的重要組成部分。不同物種的抗菌肽一級結構有相似之處，含有至少 2個正電荷氨基酸以及一定比例的疏水氨基酸[1]。防御素是一類分子量約為4.0~5.0 kDa，含有6個半胱氨酸殘基，3對二硫鍵的陽離子抗菌肽。豬 β-防御素 2 (Porcine Beta-Defensin 2，PBD-2) 是新發(fā)現(xiàn)的一種β-防御素，預測其成熟肽有 37個氨基酸，化學合成的 PBD-2活性分析表明其具有廣譜抗菌作用[2-4]，但利用基因工程手段對其進行表達還未見報道。γ干擾素是由激活的T細胞和NK細胞產生，具有抗病毒和免疫調節(jié)功能的細胞因子。豬γ干擾素 (Porcine interferongamma，PoIFNγ) 全基因為 501個堿基，編碼 166個氨基酸，前23個氨基酸為信號肽，后143個氨基酸為成熟多肽，推測含有2個糖基化位點[5-7]。1990年，Dijikmans等首先對PoIFNγ基因進行了研究[8]。迄今為止，PoIFNγ已在不同表達系統(tǒng)中獲得了表達。

巴斯德畢赤酵母 Pichia pastoris表達系統(tǒng)是一種重要的外源基因表達系統(tǒng)，迄今為止，已有多種蛋白在該系統(tǒng)中實現(xiàn)了表達[9-10]。融合蛋白 (Fusion protein，F(xiàn)P) 技術通過人工手段有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因連接在一起，進而表達所需要的蛋白。利用此技術可以構建和表達可能具有多種功能的新型目的蛋白，同時還有可能提高原蛋白的表達量。將抗菌肽單獨進行表達后，一般表達量低，純化困難，而將其串聯(lián)融合后可顯著提高表達量[11-12]，但抗菌肽與其他蛋白融合表達的報道較少。目前已有關于 γ干擾素融合蛋白的報道，一般在融合蛋白中作為免疫佐劑發(fā)揮功能[13-14]，但 PoINFγ在畢赤酵母中的表達還未見報道。通過酵母表達系統(tǒng)，如果抗菌肽與干擾素融合后能獲得高產量且抑菌抗病毒活性的融合蛋白和高產量的PoINFγ，將具有積極的意義。在此假設的基礎上，我們將通過畢赤酵母分泌表達PBD-2-PoINFγ融合蛋白與PoINFγ，并對它們的活性進行分析，同時為大規(guī)模生產PoINFγ作好準備。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 載體、菌株、病毒和細胞株

畢赤酵母表達載體pPICZαA和P. pastoris表達菌株X33購自Invitrogen公司；大腸桿菌E. coli DH5α、vesicular stomatitis virus (VSV) 及 Madin-Darby Bovine Kidney Cells (MDBK)均由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶與主要試劑

限制性內切酶Xho I、Xba I和Sac I，Pfu 聚合酶和T4 DNA 連接酶均購自TaKaRa公司；酵母提取物、蛋白胨和酵母氮源堿購自Oxoid公司；DL5000 DNA marker、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自北京諾派生物科技有限公司；INFγ多克隆抗體和INFγ標準品由本實驗室自行制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因的PCR擴增

根據 Uniprot蛋白數(shù)據庫中豬 β防御素(Q6R953) 和豬γ干擾素成熟肽 (P17803) 氨基酸序列，利用DNAworks在線軟件[15]，根據畢赤酵母密碼子偏愛性[16]，自動合成14條引物 (表1)，經基因重疊延伸 PCR (Gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)[17-18]將上述兩基因融合，PBD-2置于融合蛋白N端，PoIFNγ置于融合蛋白C端 (圖1)。

圖1 融合基因序列結構示意圖Fig. 1 Sequence structure schematic of PBD-2-PoIFNγ fusion gene.

表1 融合基因引物Table 1 Primers for fusion gene

引物由北京博邁德生物科技有限公司合成，其中在引物P1的5′端引入Xho I限制性酶切位點和α信號肽裂解位點Kex2 (aaaaga)，在引物P14的5′端引入Xba I酶切位點和終止子 (taa)。通過5次PCR反應合成融合基因PBD-2-PoIFNγ。其中第1次PCR反應以P1、P2、P3、P4互為模板引物；第2次PCR反應以P5、P6、P7、P8互為模板引物；第3次PCR反應以P9、P10、P11、P12、P13、P14互為模板引物；第4次PCR反應以第1次和第2次PCR產物為模板，引物為P1和P8；第5次PCR反應以第3次和第4次PCR反應產物為模板，引物為P1和P14。利用融合基因序列，設計2條引物PorF和PorR以合成的融合基因為模板擴增PoIFNγ基因。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.2.2 PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因重組酵母表達載體的構建與鑒定

用 Xho I與 Xba I雙酶切融合基因 PBD-2-PoINFγ、PoIFNγ基因和載體pPICZαA，酶切產物經瓊脂糖電泳切膠回收后在 16℃連接過夜，分別轉化E. coli DH5α感受態(tài)細胞；提取質粒，經PCR和雙酶切鑒定正確后，送至北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序。將測序正確的重組表達質粒命名為pPICZαA-PBD- 2-PoIFNγ和pPICZαA-PoIFNγ。

1.2.3 PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因重組表達質粒的線性化和電擊轉化

用 Sac I單酶切 5~10 μg的 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ和pPICZαA-PoIFNγ重組表達質粒使之線性化，參照 Easy SelectTMPichia Expression Kit操作說明書將P. pastoris X33制備成感受態(tài)細胞，取出90 μL分別與10 μL (500 ng/μL) 線性化的重組表達質粒 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ及 pPICZαA-PoIFNγ混合，使用Bio-Rad Gene Pulser 電轉儀于1.5 kV、25 μF和 200 ?條件下電轉化，立即加入 1 mL (1 mol/L) 冰浴山梨醇。轉化的酵母細胞涂布YPDS平板 (ZeocinTM抗性濃度為 100 μg/mL)，30℃培養(yǎng)2~4 d。

1.2.4 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ高抗性菌株的篩選與鑒定

將在 YPDS平板上長出的 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ單菌落分別轉移到含高濃度ZeocinTM平板上(濃度為800 μg/mL) 進行篩選，將在高抗性平板上長出的菌落接種到5 mL YPD液體培養(yǎng)基 (ZeocinTM抗性濃度為100 μg/mL) 中，30℃培養(yǎng)過夜；提取陽性酵母基因組DNA (TIANGEN)，以原始菌和空白表達載體轉化的重組酵母菌基因組作對照，分別以PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因特異性引物，進行PCR鑒定，PCR鑒定陽性的重組子用于誘導表達。

1.2.5 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ重組菌株的誘導表達與檢測

將PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ高抗陽性重組酵母菌分別按1∶50接種到5 mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至 OD600=5~6，菌體離心后重懸于 20 mL BMMY培養(yǎng)基，體積濃度為0.5%的甲醇誘導培養(yǎng)，收集24、48、72 h誘導表達上清液，經TCA法濃縮后用SDS-PAGE初步檢測表達結果。

1.2.6 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與PoIFNγ的初步純化與鑒定

誘導表達上清液濃縮與脫鹽: 收集100 mL誘導表達上清液，分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和 90%飽和度的(NH4)2SO4進行濃度梯度鹽析沉淀，4℃放置2 h后12 000 r/min離心 10 min，沉淀產物分別溶于 2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 中，SDS-PAGE檢測沉淀結果。

Superdex 75TM分子篩層析純化融合蛋白PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ：綜合比較在不同濃度梯度下的沉淀結果，將含蛋白量大且雜蛋白少的沉淀進行透析脫鹽處理，然后再用10 kDa超濾濃縮管進行處理，去除小分子雜質，得到500 μL樣品。在AKATA系統(tǒng)上用0.5 mL/min 的緩沖液 (0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0) 平衡Superdex 75TM柱，然后以0.2 mL/min上樣500 μL，再用同一緩沖液以0.2 mL/min進行洗脫，出現(xiàn)洗脫峰后收集樣品，將收集的純化產物分別進行 SDS-PAGE與 Western blotting檢測。Western blotting的一抗為PoIFNγ多抗 (1∶5 000稀釋)，二抗為辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG (1∶2 500稀釋)。

1.2.7 PBD-2-PoINFγ融合蛋白與PoINFγ的活性檢測

瓊脂擴散法測定 PBD-2-PoINFγ融合蛋白的抑菌活性：將25 μL處于對數(shù)生長期的E. coli DH5α與55℃ LB固體培養(yǎng)基25 mL混勻后鋪平板，待其凝固后，用滅菌的打孔器 (直徑5 mm) 打孔，滴加100 μL待測的融合蛋白樣品，37℃培養(yǎng)過夜。以同體積pPICZαA空載體轉化的X33酵母表達蛋白為陰性對照，10 μL Kana (25 μg/mL) 為陽性對照。第2天測量抑菌直徑 (抑菌直徑=抑菌圈直徑?加樣孔直徑)。

細胞病變抑制法測定 PBD-2-PoINFγ融合蛋白與 PoINFγ的抗病毒活性：以含有 10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)MDBK細胞，傳代2次。用完全培養(yǎng)基稀釋成每1 mL含2.5×105~3.5×105個細胞的細胞懸液，接種于96孔細胞板中，每孔100 μL，于同上的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5 h。將配制的干擾素標準品、PoINFγ和 PBD-2-PoINFγ樣品溶液移入接種MDBK細胞的培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL。培養(yǎng)18~24 h，棄去培養(yǎng)板中的上清，加入水泡性口炎病毒 (VSV，?80℃保存)，用含 3%小牛血清的MEM培養(yǎng)基稀釋至100 TCID50，每孔100 μL。同樣條件下培養(yǎng)24 h，然后進行染色和脫色。用酶標儀在570 nm處測定吸光值。以干擾素標準品為參照，計算PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ的效價。

1.2.8 圓二色譜測定PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二級結構

用pH 8.0的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液將純化的 PoIFNγ和 pBD-2-PoIFNγ分別配成濃度為0.2 mg/mL的溶液，在Jasco (J-810) 圓二色譜儀上測CD譜，掃描區(qū)域為遠紫外190~260 nm，樣品池光程為1 mm。

2 結果

2.1 PBD-2-PoIFNγ融合基因與 PoIFNγ基因的PCR擴增

將 PCR擴增后得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA DL5000 marker為分子質量標準，分別獲得了大小約為560 bp和460 bp的擴增帶，與預期PBD-2-PoIFNγ融合基因 (圖 2A) 與 PoINFγ基因(圖2B) 片段大小相符。

圖2 PBD-2-PoIFNγ融合基因 (A) 與PoIFNγ基因 (B) PCR擴增結果 (B)Fig. 2 Fusion gene of PBD-2-PoIFNγ (A) and gene of PoIFNγ (B) amplified by PCR. M: DNA DL 5000 marker; 1: fusion gene of PBD-2-PoIFNγ; 2: gene of PoIFNγ.

2.2 PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因重組表達載體的構建與鑒定

將連接產物分別轉化E. coli DH5α，提取質粒，用Xho I和Xba I雙酶切重組表達質粒，獲得了預期目的條帶 (圖略)。測序結果表明重組表達載體中PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因序列未發(fā)現(xiàn)突變堿基，且閱讀框正確，表明成功構建含有目的基因的重組酵母表達質粒 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ與pPICZαA-PoIFNγ。

2.3 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ陽性重組表達酵母菌株的PCR鑒定

利用 PBD-2-PoIFNγ融合基因特異性引物對(P1和P14) 和PoIFNγ特異性引物對 (PorF和PorR)分別對 ZeocinTM抗性平板篩選出的 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ酵母菌株進行PCR鑒定。從圖3中可以看出，分別擴增出約560 bp (圖3A) 和460 bp (圖3B) 的片段，均與理論大小相符，表明線性化的pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ與 pPICZαA-PoIFNγ成功與酵母菌X33染色體基因組整合。

圖3 PBD-2-PoIFNγ (A) 與PoIFNγ (B) 重組酵母菌株的PCR鑒定Fig. 3 Identification of recombinant yeast of PBD-2-PoIFNγ (A) and PoIFNγ (B) by PCR. M: DNA DL5000 marker; 1: negative control; 2: positive control; 3: positive yeast of PBD-2-PoIFNγ, 560 bp fragment amplified with specific primer; 4: positive control; 5: negative control; 6: positive yeast of PoIFNγ, 460 bp fragment amplified with specific primer.

2.4 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與 PoIFNγ的誘導表達

將選出的PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ高抗陽性酵母菌株以及陰性對照菌 X33和只轉入空載體pPICZαA的陰性對照菌分別在含 0.5%(V/V)甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)后，離心取上清，濃縮后進行 SDS-PAGE電泳。都發(fā)現(xiàn)兩條明顯特異性條帶，與理論大小相符，而陰性對照菌和轉入空載體的對照菌未見相應條帶 (圖略)。

2.5 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與PoIFNγ的初步純化與鑒定

2.5.1 誘導表達上清的鹽析與脫鹽

將陽性PBD-2-PorIFNγ重組酵母菌誘導表達上清分別用 20%~90%飽和度(NH4)2SO4沉淀后，用pH 8.0的0.1 mol/L Tris-HCl溶解，SDS-PAGE檢測沉淀產物 (圖4)。其中在70% (NH4)2SO4濃度時得到的PBD-2-PoIFNγ沉淀量最大，但雜蛋白也較多。而在 50% (NH4)2SO4濃度時得到的 PBD-2-PoIFNγ純度較高，雜蛋白較少，經透析后可以直接用分子篩進行純化，得到純度更高的目的蛋白。而PoIFNγ重組酵母菌的誘導表達上清直接用50% (NH4)2SO4濃度進行沉淀，經相同處理后進行分子篩純化。

2.5.2 Superdex 75TM分子篩層析純化PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ

含PBD-2-PoIFNγ或PoIFNγ的濃縮脫鹽樣品分別經Superdex 75TM分子篩層析處理后，將收集液進行 SDS-PAGE和 Western blotting。圖 5 (PBD-2-PoIFNγ) 中主要有2個洗脫峰，第1個峰為雜蛋白峰，第 2個峰為目的蛋白峰。從圖6A和圖 6B的SDS-PAGE結果中發(fā)現(xiàn)2條無法分開的蛋白條帶，Western blotting 分析檢測也是如此，說明這 2條帶都能有效結合PoIFNγ多克隆抗體，據此推測 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與 PoIFNγ以兩種形式存在。

圖4 硫酸銨鹽析PBD-2-PoIFNγ的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE of PBD-2-PoIFNγ by salting-out lane with ammonium sulphate. M: protein marker; 1–8: 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% (NH4)2SO4.

圖5 Superdex 75TM分子篩層析純化pBD-2-PoIFNγFig. 5 Purification of pBD-2-PoIFNγ by Superdex 75TM size-exclusion chromatography. P1: peaks of other protein; P2: elute peaks of target protein.

圖6 純化的PBD-2-PoIFNγ (A) 與PoIFNγ (B) SDS-PAGE和Western blotting分析Fig. 6 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) analysis of purified PBD-2-PoIFNγ. M: protein marker; 1: sample of PBD-2-PoIFNγ; 2: purified PBD-2-PoIFNγ; 3: identification of purified PBD-2-PoIFNγ by Western blotting; 4: sample of PoIFNγ; 5: purified PoIFNγ; 6: identification of purified PoIFNγ by Western blotting.

2.6 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與 PoIFNγ的活性檢測

細胞病變抑制法實驗結果顯示測定的 PoIFNγ效價達到 105~106U/mg。陰性對照和經不同濃度梯度的融合蛋白處理的MDBK細胞都出現(xiàn)了病變，而標準INFγ處理過的MDBK細胞并沒有發(fā)生病變；瓊脂孔穴擴散測定結果表明融合蛋白并不能抑制大腸桿菌DH5α，融合蛋白pBD-2-PoIFNγ沒有像單獨的pBD-2一樣具有廣譜的抑菌作用。

2.7 圓二色譜測定PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ的二級結構

對純化的PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ進行圓二色譜測量，測定的 CD譜圖利用 Secondary Structure Estimation軟件包對其CD譜進行最小二乘法修正計算和擬合 (圖7)，表2列出了用圓二色譜法測定的PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二級結構含量，從計算結果中可以看到片層和轉角含量相差不大，而螺旋和無規(guī)則卷曲含量差別較大，可推測是部分螺旋結構變?yōu)闊o規(guī)則卷曲影響了 PBD-2-PoIFNγ的抗病毒活性。

表2 PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ蛋白的二級結構比較Table 2 Comparison of the secondary structures of PoIFNγ and PBD-2-PoIFNγ

圖7 PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ的CD圖譜Fig. 7 CD spectra of PoIFNγ and PBD-2-PoIFNγ.

3 討論

通常融合基因的拼接大多采用限制性內切酶消化和連接酶處理的方法得到，但是費時費力，非常不方便，而重疊延伸PCR技術能快速獲得其他依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的基因產物。該技術成功的關鍵是重疊互補引物的設計，DNAWORKS程序能根據密碼子偏愛性，方便、準確地指導寡核苷酸的設計，能最大限度地減少引物“發(fā)夾”結構形成，使體外基因拼接工作更易進行。本實驗通過DNAWORKs設計14條引物，根據SOE法原理分 5次 PCR方便地合成了融合蛋白基因PBD-2-PoIFNγ。在融合基因序列基礎上，我們擴增出了PoIFNγ基因的序列，并用相同載體和酵母菌實現(xiàn)了PBD-2-PoIFNγ融合蛋白和PoIFNγ的表達。本實驗中所使用的P. pastoris菌株X33是野生型，耐受性比較好，在含甲醇的培養(yǎng)基中能快速生長，表達載體pPICZαA含有α-MF信號肽序列，在信號肽序列和目的蛋白序列之間引入Kex2蛋白酶切位點，可以在目的蛋白質分泌到胞外時將信號肽切除[19]。由于酵母分泌表達得到大量的上清液，內含一些雜質，直接進行分離純化并不方便，通過鹽析方法，可以將蛋白質在保持活性的前提下得到濃縮和粗分離。本實驗首先通過硫酸銨分級梯度沉淀法，獲得了較佳蛋白沉淀量但雜蛋白較少時的飽和硫酸銨濃度，在該濃度下將含有融合蛋白 PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ的上清液進行濃縮，透析脫鹽后，經過一次分子篩純化即可得到純度較高的蛋白。通過SDS-PAGE和 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，無論PBD-2-PoIFNγ融合蛋白還是PoIFNγ都有2條明顯的條帶，因為PoIFNγ上具有2個糖基化位點，推測這2條帶可能是糖基化水平不同造成的。

本實驗將純化后的融合蛋白 PBD-2-PoIFNγ通過細胞病變抑制法和瓊脂孔穴擴散法進行了活性分析，實驗結果表明融合蛋白沒有抗病毒和抑菌效果，但非融合的PoIFNγ具有很好的抗病毒效果。原因分析如下：抗菌肽 N末端有較強的形成兩親α螺旋的趨勢，帶電荷氨基酸均在螺旋一側分布；C端有形成疏水螺旋的傾向[1,20]。目前被學界比較認可的抗菌肽作用機制是:首先抗菌肽的多聚體與細胞膜相互吸引使抗菌肽結合到膜上；然后抗菌肽的疏水C端插入膜中，而形成兩親α螺旋的N端留在膜界面上；最后兩親性的α螺旋插入質膜，在質膜上形成較大孔洞，從而使細胞死亡。由于PBD-2是置于融合蛋白N端，而C端連接具較長肽鏈的PoIFNγ，使其C端不能插入到膜中，從而無法使其N端與細菌表面相互作用而失去活性[21]。通過圓二色譜分析發(fā)現(xiàn)，PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二級結構中螺旋差別較大，推測可能是部分螺旋結構變?yōu)闊o規(guī)則卷曲影響了PBD-2-PoIFNγ的空間結構，進而影響了其抗病毒活性。融合蛋白中的PBD-2和PoIFNγ都帶有很強的正電荷，但由于當初設計融合蛋白時并沒有用間隔序列進行連接，可能正是因為它們近距離的互斥強電荷影響了融合蛋白的二級結構，進而影響空間結構，使融合蛋白無法以二聚體形式存在，從而造成了融合基因雖在畢赤酵母中得到了正常表達，但無法發(fā)揮各自的正常功能。如果通過調換抗菌肽和干擾素的位置，并且在融合蛋白之間加入間隔序列可能會產生有活性的融合蛋白。

本研究通過 SOE PCR合成融合基因 PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ基因，并成功在畢赤酵母中表達出融合蛋白PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ。雖然PBD-2與 PoIFNγ融合后的活性分析表明我們采用的融合方式并不能有效發(fā)揮它們之間的協(xié)同性，但實驗結果為進一步深化對抗菌肽和干擾素融合蛋白研究提供了有益啟示，同時獲得的有活性的PoIFNγ也為大規(guī)模生產打下了基礎。

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