張國(guó)民 ，譚周進(jìn) ，張 熙 ，蔡光先

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

微生物體積小，種類多，分布廣泛，代謝類型和代謝產(chǎn)物極其多樣，對(duì)人類生產(chǎn)、生活的影響巨大。微生物擁有極其復(fù)雜多樣的酶類，可以通過(guò)羥基化、環(huán)氧化、脫氫、氫化等氧化還原反應(yīng)，或水解、水合、酯化、胺化、脫水、異構(gòu)化和芳構(gòu)化等反應(yīng)改變物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其物理化學(xué)性質(zhì)，影響其生理活性與功能[1]。現(xiàn)就微生物通過(guò)酶法修飾改變化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而提高其活性，降低毒副作用，產(chǎn)生新活性物質(zhì)等的研究進(jìn)展綜述如下。

1 微生物作用可提高中藥活性

微生物通過(guò)對(duì)藥物中有效成分的修飾，可以顯著提高其生物活性，從而獲得更好的治療效果。微生物轉(zhuǎn)化提高藥物活性的主要表現(xiàn)方式有提高活性成分的量，改變活性成分的比例，生物轉(zhuǎn)化體系產(chǎn)生了次級(jí)代謝產(chǎn)物以及有效成分發(fā)生復(fù)方協(xié)同作用等[2]。

薛慧玲等[3]利用篩選獲得的β-葡萄糖醛酸酶產(chǎn)生菌HQ 210對(duì)黃芩中的主要前體物質(zhì)黃芩苷進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后黃芩素得率是原藥材的5.3倍，有效成分得到濃縮。任莉穎等[4]通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)炮制紅花，使紅花有效成分的酚羥基數(shù)目大幅提高，進(jìn)一步提高了紅花的抗氧化性和生物利用率。

陳永強(qiáng)等[5]通過(guò)篩選得到的產(chǎn)β-葡萄糖醛酸酶的黃曲霉HG 12對(duì)甘草進(jìn)行液體發(fā)酵炮制，發(fā)現(xiàn)甘草經(jīng)黃曲霉HG 12轉(zhuǎn)化后，甘草中的甘草酸水解為甘草次酸。動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，發(fā)酵后甘草的抗炎、鎮(zhèn)痛活性較未發(fā)酵甘草有顯著性提高，并且起效迅速。淫羊藿是常用中藥，主要成分為淫羊藿苷，有增強(qiáng)內(nèi)分泌、促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA合成和骨細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，而低糖基淫羊藿苷和淫羊藿苷元的活性均明顯高于淫羊藿。利用曲霉屬霉菌產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶水解淫羊藿苷，可制得低糖基淫羊藿苷或淫羊藿苷元，且轉(zhuǎn)化率高[6]。虎杖為蓼科植物虎杖的干燥根莖，主要有效成分白藜蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗動(dòng)脈粥樣硬化和預(yù)防冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的作用。干燥虎杖根莖中白藜蘆醇含量?jī)H為0.1% ～0.2%，而虎杖苷含量為2%左右。張強(qiáng)華等[7]從中藥材虎杖中篩選到具有轉(zhuǎn)化虎杖苷能力的根霉菌株T 234，利用該菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶能將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。苷類中藥生物利用度低，攝入后需經(jīng)腸道細(xì)菌代謝水解生成苷元而發(fā)揮藥理作用。因此，將苷類中藥轉(zhuǎn)化成苷元，提高生物利用度是有效提高其藥效的一個(gè)重要方法[8]。人參皂苷Rg1在肝臟內(nèi)基本不代謝，甘草皂苷、柴胡皂苷等也都是經(jīng)過(guò)腸道微生物的轉(zhuǎn)化作用，才表現(xiàn)出抗炎、抗癌、抗病毒等藥理作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道中的細(xì)菌 Bacteroides JY-6，Bacteroides SP.，Bifidobacterium SP.和 Fusobacterium SP.等能夠代謝人參皂苷成分[10]。趙玉婷等[11]從盾葉薯蕷根莖表面及葉片中篩選到可降解薯蕷皂苷為薯蕷皂苷元的菌株。沈嵐等[12]研究發(fā)現(xiàn)，不管是離體還是在體內(nèi)條件下，麥冬皂苷D′在大鼠腸道菌作用下均能被代謝成薯蕷皂苷元，且最終在血液、尿液中也可檢出薯蕷皂苷元。羅漢果是葫蘆科植物羅漢果的干燥成熟果實(shí)，性涼、味甘，中醫(yī)用于治療百日咳、慢性氣管炎等。已有研究表明，羅漢果主要含有皂苷類化學(xué)成分，羅漢果皂苷（mogroside）Ⅲ是羅漢果總皂苷類化學(xué)成分中含量較高的成分之一。楊秀偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)羅漢果皂苷Ⅲ可由人腸內(nèi)細(xì)菌依次脫去C-3葡萄糖基和C-24龍膽二糖基，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生羅漢果皂苷ⅡA1和羅漢果醇，從而大大提高了羅漢果有效成分的吸收率。

改變中藥有效成分的水溶性也可以提高其藥效活性。葛根素是葛根中的主要有效成分，但因其水溶性差，不能通過(guò)注射給藥。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的麥芽糖淀粉酶可以顯著提高葛根素的水溶性，反應(yīng)得到的兩種主要產(chǎn)物α-D-葡萄糖基-（1→6）-葛根素和α-D-麥芽糖基 -（1→6）-葛根素，其溶解度分別是葛根素的14倍和168倍[14]。去氫木香內(nèi)酯和木香烯內(nèi)酯為常用中藥木香的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)等藥理活性，但水溶性較差。為尋找活性和水溶性更好的藥物，李澤友等[15]利用多型孢毛霉 Mucor polymorphosporus AS 313443等真菌對(duì)去氫木香內(nèi)酯進(jìn)行制備型轉(zhuǎn)化，分離得到9個(gè)化合物，從而使其水溶性明顯提高。

2 微生物作用可降低化學(xué)物質(zhì)毒性

2.1 降低中藥毒副作用

某些藥效明顯的中藥或化學(xué)合成藥往往伴有強(qiáng)烈的毒副作用，限制了其廣泛使用，而微生物轉(zhuǎn)化作用可以顯著降低中藥的毒性。微生物在轉(zhuǎn)化過(guò)程中主要通過(guò)對(duì)有毒物質(zhì)進(jìn)行分解或?qū)τ卸净钚猿煞诌M(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而降低藥物的不良反應(yīng)[16]。

五倍子的主要成分為五倍子鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸等，具有收斂止瀉、止血的作用，但鞣酸在腸道內(nèi)會(huì)結(jié)合食物中的蛋白質(zhì)，引起部分患者服用后食欲不振。鄭利華等[17]用含有根霉菌的酵曲發(fā)酵五倍子，發(fā)酵后能顯著提高五倍子的收斂作用，并降低或消除了由鞣酸引起的不良反應(yīng)。大黃生用瀉下作用峻烈，易引起腹痛、惡心等胃腸道反應(yīng)，其瀉下作用成分主要是結(jié)合型蒽醌衍生物，故在中醫(yī)臨床中，常用不同的炮制方法使結(jié)合型蒽醌分解或破壞，從而緩和瀉下作用和其他副作用。戴萬(wàn)生等[18]用酵母菌發(fā)酵大黃，結(jié)果大黃總蒽醌含量略有降低，結(jié)合型蒽醌含量降低，分離型蒽醌含量增加，起到了減毒增效的作用。

馬錢子因是劇毒藥而臨床應(yīng)用受限，目前主要用砂燙法和油炸法降低其毒性。潘揚(yáng)等[19]通過(guò)真菌對(duì)馬錢子進(jìn)行“雙向發(fā)酵”，結(jié)果發(fā)酵后馬錢子類生物堿成分發(fā)生了質(zhì)和量的明顯變化，提示該技術(shù)在馬錢子的減毒增效研究中有重要意義。喜樹是珙桐科喬木，其有效成分喜樹堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但嚴(yán)重的胃腸毒性、抑制骨髓功能和致出血性膀胱炎等毒副作用制約了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。10-羥基喜樹堿是喜樹堿的結(jié)構(gòu)類似物，對(duì)多種癌癥具有顯著的療效，且毒副作用很低，但在喜樹中的含量?jī)H為十萬(wàn)分之二，提取分離費(fèi)時(shí)、費(fèi)力[20]。閔長(zhǎng)莉等[21]采用無(wú)毒黃曲霉菌株T-419，將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿，顯著降低其毒副作用，提高了生物利用度。蟾蜍甾烯為中藥蟾酥的主要有效成分，是一類C-17位連接六元不飽和內(nèi)酯環(huán)的甾體化合物，具有強(qiáng)心、局部麻醉、抗休克、抗病毒、抗腫瘤等多種生理活性，但其化合物對(duì)人體有一定的毒副作用，主要表現(xiàn)為呼吸急促和心律不齊，過(guò)量則會(huì)因麻痹而致死亡，從而嚴(yán)重影響了其臨床應(yīng)用[22]。梁研等[23]利用毛霉屬真菌對(duì)蟾蜍甾烯化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，獲得了80余個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中大部分為新化合物，大大降低了蟾蜍甾烯化合物的毒性。洋地黃強(qiáng)心苷類藥物是一類有強(qiáng)心作用的苷類化合物，應(yīng)用于臨床可以治療充血性心力衰竭。對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以得到高效、低毒的強(qiáng)心苷類藥物，成為該類藥物研究開發(fā)的方向之一。胡之璧院士應(yīng)用洋地黃懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，篩選出洋地黃轉(zhuǎn)化菌株新月彎孢霉 Curvularia lunata和藍(lán)色犁頭霉 Absidia coerulea，經(jīng)轉(zhuǎn)化后甾體母核C12位上增加了一個(gè)羥基，將洋地黃毒苷羥化為地高辛，從而降低了其毒性[24]。

2.2 降低環(huán)境中物質(zhì)的毒副作用

隨著農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用，環(huán)境中殘留農(nóng)藥量不斷增加，并經(jīng)食物鏈傳遞而污染農(nóng)產(chǎn)品，對(duì)人類健康構(gòu)成了威脅，影響社會(huì)的持續(xù)發(fā)展。在農(nóng)藥污染的治理方法中，生物修復(fù)技術(shù)是目前國(guó)際上公認(rèn)最安全的方法，而微生物修復(fù)在生物修復(fù)中起著主導(dǎo)作用。

微生物酶法修飾可降解環(huán)境中的有毒物質(zhì)。阮少江等[25]研究發(fā)現(xiàn)，甲胺磷農(nóng)藥經(jīng)微生物產(chǎn)生的甲胺脫氫酶催化分解為氨基、磷酸根和甲醇等化合物，通過(guò)小鼠灌胃試驗(yàn)證明，該農(nóng)藥的毒性明顯降低。Mageong等[26]報(bào)道大腸桿菌產(chǎn)生的磷酸三酯酶能打開甲胺磷的P-S鍵。Hay等[27]發(fā)現(xiàn)了 Pseudomonas acidovorans M3GY以聯(lián)苯為碳源共代謝降解雙對(duì)氯苯基三氯乙烷（DDT）的途徑，該菌株先將 DDT 脫氯化氫生成 2，2-雙（4-氯苯基）-1，1，1-二氯乙烯（DDE），再由雙加氧酶在苯環(huán)上引入雙羥基，苯環(huán)開環(huán)后經(jīng)一系列代謝過(guò)程生成對(duì)氯苯甲酸及對(duì)氯苯乙酸。阿特拉津是一種低毒除草劑，但長(zhǎng)期大范圍使用易造成土壤、地表水、地下水等的污染，其降解菌主要有紅球菌（Rhodococcus）、假單胞菌（Pseudomonas）等，降解途徑包括水解、脫烷基、開環(huán)3個(gè)過(guò)程，參與的酶主要有阿特拉津氯水解酶、阿特拉津乙氨基水解酶和N-異丙基氰尿酰胺異丙基氨基水解酶等[28]。

甲基化是微生物對(duì)環(huán)境中砷的一種重要解毒機(jī)制。自然界中，許多真菌和細(xì)菌能夠通過(guò)甲基化將無(wú)機(jī)砷轉(zhuǎn)化為毒性較低的甲基砷酸，如一甲基砷酸（MMAA）、二甲基砷酸（DMAA）、三甲基砷氧化物（TMAO）。張旭等[29]利用嗜酸硫桿菌 Acidithiobacillus ferrooxidans BY-3與 Acidithiobacillus thiooxidans BY-1對(duì)雄黃的微生物溶解與轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，毛細(xì)管電泳分析表明，可溶性的一甲基砷酸與二甲基砷酸為雄黃微生物溶出液的主要成分。

3 微生物轉(zhuǎn)化可合成新活性物質(zhì)

在新藥的研發(fā)中，通常也利用微生物對(duì)已知成分的藥物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)而篩選獲得新型、高效、低毒的藥物。在中藥開發(fā)中，由于中藥活性成分一般結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常有多個(gè)不對(duì)稱碳原子，利用化學(xué)合成來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾存在著得率低、反應(yīng)專一性差、副產(chǎn)物多等缺點(diǎn)。而利用微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化容易生成新的化學(xué)結(jié)構(gòu)，很多轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有新的活性，從而為新藥開發(fā)提供了難得的先導(dǎo)化合物[30]。以已知的天然活性成分為先導(dǎo)化合物，通過(guò)有機(jī)合成、結(jié)構(gòu)改造等方法尋找和開發(fā)新的高效低毒藥物，是被實(shí)踐證明的開發(fā)新藥最行之有效的途徑之一。

利美索龍（Rimexolone）又名瑞美松龍，是一類新型甾體類眼科糖皮質(zhì)激素藥物，具有較強(qiáng)的抗炎、抗過(guò)敏功能，用化學(xué)方法合成其前體化合物 16，17-dimethyl-17- （1-oxopropyl）androsta-1，4-dien-3-one后，在C11位上實(shí)現(xiàn)β-羥基化即可形成目的產(chǎn)物利美索龍，但該化學(xué)合成程序煩瑣且十分困難。張?zhí)熘堑萚31]研究表明，絲狀真菌新月彎孢霉 Curvularia lunata具有對(duì)前體化合物C11 β-羥基化的能力，應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化手段，直接對(duì)底物引入C11 β-羥基，合成目標(biāo)產(chǎn)物，可以有效簡(jiǎn)化利美索龍的生產(chǎn)工藝。王永宏等[32]篩選了一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的青霉菌株，對(duì)梔子進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵條件優(yōu)化后β-葡萄糖苷酶活性可達(dá)8.2 U/mL，使梔子中主要成分京尼平苷轉(zhuǎn)化成藥效更強(qiáng)的京尼平，且轉(zhuǎn)化率達(dá)95%以上。吳秀麗等[33]發(fā)現(xiàn)真菌菌株EST-Ⅰ與EST-Ⅱ能產(chǎn)生特異性水解C-6位葡萄糖的β-葡萄糖苷酶，可以將人參皂苷Rg1定向轉(zhuǎn)化為稀有的人參皂苷F1。張卉等[34]使用微紫青霉對(duì)莪術(shù)醇進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)微紫青霉可將莪術(shù)醇轉(zhuǎn)化為15-羥基莪術(shù)醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)到24%，且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為未見文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物，體外試驗(yàn)表明其對(duì)副流感病毒、呼吸道合胞病毒和單純皰疹病毒Ⅰ型有較好的抑制作用。賈艷萍等[35]通過(guò)試驗(yàn)確定 Absida SP.MS2為生產(chǎn)紅景天苷合成酶的出發(fā)菌株，可采用菌株 Absida SP.MS2發(fā)酵得到粗酶液，以酪醇和葡萄糖為底物合成紅景天苷。莪術(shù)油是中藥莪術(shù)的主要成分，具有抗腫瘤、抗病毒等功用，臨床用于治療宮頸癌、外陰癌、胃部腫瘤等疾病。莪術(shù)醇是莪術(shù)油的主要藥效成分之一，孫敏鴿等[36]使用蕁麻青霉 Penicillium urticae對(duì)莪術(shù)醇進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，結(jié)果分離到2個(gè)產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)分別鑒定為3-α-羥基莪術(shù)醇和11-R-12-羥基莪術(shù)醇，其中3-α-羥基莪術(shù)醇為未見文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物。

綜上所述，微生物通過(guò)酶修飾作用于某些中藥，改變其有效成分的結(jié)構(gòu)，就可以大大提高藥效活性；改變某些有毒物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，就能起到減毒效果。微生物的次生代謝產(chǎn)物還可以和中藥的有效成分發(fā)生復(fù)方、協(xié)同作用。微生物通過(guò)酶作用，可以促進(jìn)一些具有新活性的物質(zhì)的合成。降解微生物擁有特殊的酶系，作用于各種污染物，可以改變其物質(zhì)結(jié)構(gòu)，將其徹底或部分降解成無(wú)機(jī)小分子物質(zhì)，從而失去污染能力。微生物酶轉(zhuǎn)化通常是以天然活性成分為先導(dǎo)化合物，利用多種不同催化功能的酶體系對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，這些修飾往往發(fā)生在化合物的母核結(jié)構(gòu)上。在確定了中藥活性成分、有機(jī)污染物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)關(guān)系的基礎(chǔ)上，如何從細(xì)胞和分子水平闡明轉(zhuǎn)化的反應(yīng)機(jī)制，是更深層次的問(wèn)題之一。這不僅需要鑒定反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，還需要推測(cè)可能的反應(yīng)歷程，確定生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵酶及其基因序列，進(jìn)行關(guān)鍵酶的分離以及酶在組織和亞細(xì)胞中的定位等。因此，深刻了解微生物對(duì)化學(xué)物質(zhì)構(gòu)效的影響機(jī)制，有待微生物學(xué)、藥學(xué)、分子生物學(xué)和代謝工程等多學(xué)科的協(xié)同研究，努力探索生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，為生物轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步發(fā)展開辟空間。

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