黃國民,劉林林,喬士興,房學(xué)東*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院1.普通外科疾病診療中心;2.腫瘤生物治療中心,吉林長春130041)

淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的主要途徑,也是影響術(shù)后復(fù)發(fā)及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。環(huán)氧合酶-2(COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶,參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤細(xì)胞通過淋巴管擴(kuò)散到區(qū)域淋巴結(jié)是癌細(xì)胞侵襲性的重要表現(xiàn),在癌組織切片中可見未成熟期淋巴管,在這些淋巴管中經(jīng)?？梢砸姷匠纱氐哪[瘤細(xì)胞,提示腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管生成可能是轉(zhuǎn)移進(jìn)展的重要因素[2]。但有關(guān)COX-2對淋巴管形成的影響研究甚少,其具體機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討COX-2對胃癌淋巴管形成及預(yù)后的影響,并對其可能的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 對象與試劑

1.1.1 患者資料 收集我院2004年2月-2004年10月臨床資料完整的手術(shù)切除的并經(jīng)病理證實的胃癌患者63例,其中男性為40例,女性為23例。年齡29歲-75歲,中位年齡54歲。所有標(biāo)本術(shù)前均未接受放療和化療。組織學(xué)檢查為正常胃粘膜者20例源于胃鏡活檢標(biāo)本。病理類型:高分化腺癌13例,中分化腺癌15例,低分化腺癌26例。TNM 分期:I期8例,II期13例III期18例IV期19例。本組63例均獲臨床隨訪,隨訪時間58-76個月,患者生存時間8-76個月,中位生存時間37個月。

1.1.2 主要試劑 人胃腺癌細(xì)胞系SGC7901購自中科院上海生物研究所,尼美舒利購于Sigma公司,前列腺素E2(PGE2)購于美國Cayman化學(xué)公司,羊抗人COX-2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,羊抗人VEGF-C單克隆抗體、VEGFR-3單克隆抗體購于武漢博士德生物技術(shù)開發(fā)公司,Western印跡法試劑盒購于美國Promega公司。VEGF-C上游引物5′-AGACTCAATGCATGCCACG-3′,5′-TTGAGTCATCTCCAGCATCC-3(435 bp)。β-actin:5′-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′,5′-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′(479 bp)。引物由上海生工公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 COX-2、VEGF-C、VEGFR-3 免疫組織化學(xué)檢測及淋巴管密度計數(shù):按S-P免疫試劑盒說明書操作。COX-2、VEGF-C以細(xì)胞質(zhì)染色為棕或棕褐黃色為陽性細(xì)胞,計算每例切片5個高倍視野中陽性染色反應(yīng)細(xì)胞的百分率,小于10%判定為陰性(-),大于10%判定為陽性(+)。VEGFR-3染成棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均為一個為微淋巴管計數(shù),每例首先在低倍鏡下選擇MLD最高的腫瘤區(qū)域,在200倍光鏡下,隨機(jī)計數(shù)5個視野內(nèi)微淋巴管數(shù),再求其平均值,MLD以±s表示。

1.2.2 不同濃度尼美舒利對VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)的影響:用0、50、100和200 μ mol/L的尼美舒利作用細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞,置于-80℃保存?zhèn)溆?。提取mRNA進(jìn)行定量和定性分析。RT-PCR:采用TRlzol一步法抽提胃癌組織總RNA,經(jīng)DNA酶消化后逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄和PCR均設(shè)陰性對照。取5 μ l擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μ l溴酚藍(lán),2%瓊脂糖電泳分析,凝膠成像儀分析逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物帶的積分吸光度值。用VEGF-C/β-actin擴(kuò)增量表示細(xì)胞的相對表達(dá)水平。

分別用 0、50、100 、和 200 μ mol/L 尼美舒利作用SGC-7901細(xì)胞48 h。加入4℃蛋白裂解液,冰上裂解3 min;4℃1 000 g離心10 min;取上清,考馬斯亮藍(lán)測蛋白濃度,-80℃保存。取相同劑量的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,隨后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜,5%脫脂奶粉封閉緩沖液室溫封閉30 min,加入1∶500稀釋的VEGF-C一抗,4℃孵育過夜。用Western印跡試劑盒檢測VEGF-C蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 不同濃度的PGE2對SGC-7901細(xì)胞VEGF-C蛋白表達(dá)的影響:SGC-7901細(xì)胞分別加入濃度為0、50 、100、和 200 μ mol/L 的 PGE2,培 養(yǎng) 24 h,收 集細(xì)胞,按前述方法檢測VEGF-C蛋白表達(dá)水平

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有資料經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料采用t檢驗,計數(shù)資料采用 χ2檢驗,相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析,生存分析采用Kaplan-Meier曲線,單因素分析采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2和VEGF-C在胃癌中的表達(dá)及VEGFR-3標(biāo)記的淋巴管特點(diǎn)

COX-2、VEGF-C在正常胃粘膜組未見表達(dá)。COX-2在胃癌組織中陽性率分別為77.6%(66/85),其陽性產(chǎn)物為棕黃色,位于癌細(xì)胞胞漿內(nèi);VEGF-C在胃癌組織中陽性率分別為72.9%(62/85),其陽性產(chǎn)物為棕黃色,位于癌細(xì)胞胞漿內(nèi),兩者差異具有顯著性(P＜0.05)。VEGFR-3陽性產(chǎn)物表達(dá)于腫瘤間質(zhì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中,淋巴管分布腫瘤周邊多于間質(zhì),形態(tài)大小不一;部分淋巴管內(nèi)可見癌細(xì)胞浸潤。VEGFR-3在胃癌組織中MLD為(8.94±0.90)正常胃粘膜組MLD為(2.11±0.91),兩組相比,差異具有顯著性(P＜0.05)。

2.2 COX-2與VEGF-C、MLD的表達(dá)關(guān)系

COX-2表達(dá)陽性的49例胃癌中有VEGF-C表達(dá)陽性的有42例,COX-2表達(dá)陰性的14例胃癌中有VEGF-C表達(dá)陽性的有 3例,兩者比較COX-2與VEGF-C表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。COX-2表達(dá)陽性的49例胃癌中平均MLD為12.05±0.21,而陰性的14例中MLD為5.13±0.29兩者比較差異有顯著性(P＜0.05)。

2.3 COX-2、VEGF-C與胃癌淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

淋巴管密度與 COX-2(r=0.41,P=0.01)、VEGF-C(r=0.45,P＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=0.69,P＜0.01)呈正相關(guān)。COX-2表達(dá)陽性的66例胃癌中有VEGF-C表達(dá)陽性的有57例,COX-2表達(dá)陰性的19例胃癌中有VEGF-C表達(dá)陽性的有2例,COX-2與VEGF-C表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。

2.4 COX-2、VEGF-C與胃癌預(yù)后的分析

經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析COX-2、VEGF-C表達(dá)均與生存率負(fù)相關(guān),COX-2陽性表達(dá)組患者5年生存率15.6%陰性表達(dá)患者為36.8%,VEGF-C陽性表達(dá)組患者5年生存率16.8%陰性表達(dá)患者為35.7%,log-rank檢驗兩組生存曲線差異有非常顯著性意義(P＜0.05)。

2.5 COX-2對淋巴管形成的影響

選擇性COX-2抑制劑尼美舒利以劑量依賴性方式抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞VEGF-C mRNA的表達(dá)。加入不同劑量的PGE2后,PGE2以劑量依賴性方式上調(diào)VEGF-C的表達(dá),PGE2濃度越高,VEGF-C mRNA表達(dá)越明顯。

3 討論

環(huán)氧合酶-2(COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶,在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),COX-2參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1,3]。有研究發(fā)現(xiàn)在人結(jié)腸癌中COX-2可通過上調(diào)VEGF-C表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸癌的淋巴管形成[4]。然而,COX-2能否通過上調(diào)VEGF-C表達(dá)并促進(jìn)胃癌淋巴管形成以及胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移目前尚不清楚。

VEGF-C被認(rèn)為是相對特異的淋巴管內(nèi)皮生長因子,在對影響淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素的研究中發(fā)現(xiàn),VEGF-C及VEGFR-3是目前為止發(fā)現(xiàn)的一組調(diào)節(jié)胚胎組織淋巴管生成和成熟個體淋巴管生理功能的調(diào)節(jié)因子,它通過誘導(dǎo)微淋巴管的生成并影響淋巴管內(nèi)皮的通透性,從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[5]。本研究表明VEGF-C與淋巴管密度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),與生存率呈負(fù)相關(guān),并影響胃癌患者的預(yù)后,COX-2表達(dá)與VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)。COX-2表達(dá)和VEGF-C表達(dá)與淋巴管密度呈正相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者COX-2、VEGF-C的表達(dá)明顯增高,并與患者的無病生存率和總生存率呈負(fù)相關(guān)。淋巴管密度是胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險因素,提示COX-2和VEGF-C的高表達(dá)與胃癌淋巴管形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),并影響胃癌患者的預(yù)后。

COX-2和VEGF-C在胃癌淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的確切機(jī)制和關(guān)鍵步驟,迄今仍未明了。有研究認(rèn)為少數(shù)COX-2為調(diào)節(jié)基因,推測某些未知的COX-2下游基因可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。我們研究結(jié)果表明,胃癌組織中COX-2表達(dá)與VEGF-C呈正相關(guān),COX-2特異性抑制劑尼美舒利可明顯抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞VEGF-C mRNA和蛋白的表達(dá),尼美舒利濃度越高,VEGF-C表達(dá)降低越明顯,其抑制效果呈劑量依賴性。另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PGE2,可誘導(dǎo)VEGF-C表達(dá)上調(diào),實驗表明,VEGF-C是COX-2的下游基因,COX-2通過PGE2上調(diào)VEGFC的表達(dá),VEGF-C通過作用與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體,進(jìn)而促進(jìn)淋巴管的形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨著COX-2、VEGF-C與胃癌關(guān)系研究的深入有可能為研究腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移開辟新的途徑。

[1]黃國民,房學(xué)東,丁相福,等.胃癌組織中環(huán)氧和酶-2的表達(dá)及意義[J].中國實驗診斷學(xué),2008,12(8):1020.

[2]Sebastian FS,Guenther B,Klaus A,Prognostic value of lymphangiogenesis and lymphovascular invasion in invasive breast cancer[J].Ann Surg USA,2004,240(2):306.

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[5]Zha S,Yegnasubramanian V,Nelson WG,etal.Cyclooxygenase-2in cancer progress and perspective[J].Cancer Lett,2004,215(1):1.