杜子婧 楊 湄 昝 濤 李青峰

熒光素酶報(bào)告基因在干細(xì)胞體內(nèi)示蹤研究中的應(yīng)用

杜子婧 楊 湄 昝 濤 李青峰

活體生物發(fā)光技術(shù)是一種新興的成像技術(shù)，是利用熒光素酶在活體內(nèi)的可檢測性、可視性和持續(xù)表達(dá)性，以暗視野CCD[1]（Charge-coupled device，電荷偶聯(lián)設(shè)備）相機(jī)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的一種成像技術(shù)，它能有效地對(duì)報(bào)告基因標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行實(shí)時(shí)、原位的觀測，可在完整的體內(nèi)環(huán)境中快速獲得時(shí)間、空間的信息。生物發(fā)光技術(shù)具有非侵入性，可以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，減少動(dòng)物個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響[2－3]。與其他活體成像技術(shù)，如磁共振成像（MRI）、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、正電子成像技術(shù)（PET）等相比，活體生物發(fā)光技術(shù)更加敏感、安全、直觀，且操作簡單，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)等多領(lǐng)域的研究[4-6]。

1 生物發(fā)光成像概述

1.1 熒光素酶報(bào)告基因

熒光素酶的種類繁多，其中主要用于研究且廣泛使用的是螢火蟲熒光素酶（Fluc）[7]。該物質(zhì)從北美螢火蟲體內(nèi)分離獲得，是由550個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)[8]，具有較低的的免疫原性[9]，可以在體內(nèi)長期存在。底物熒光素（D-luciferin），約為280 D的小分子，脂溶性，可在全身分布，不受血腦屏障和胎盤屏障的限制[10－11]。在氧氣、Mg2+和ATP的存在下，熒光素酶可與其底物相互作用，發(fā)出波長峰值為562 nm的可見光，而在正常體溫37℃時(shí)，峰值轉(zhuǎn)移到612 nm[12]，超過600 nm的波長可以將體內(nèi)血紅蛋白的吸收作用降到最低，使更多的光可以穿透組織和皮膚而被檢測到[13-14]。其他種類的熒光素酶也有不同的應(yīng)用，來源于細(xì)菌的熒光素酶（Lux）用于原核表達(dá)系統(tǒng)[15]；海腎熒光素酶（Rluc），在體內(nèi)的代謝速度較螢火蟲熒光素酶快，所發(fā)波長在460～540 nm，大部分的光被組織吸收，因此該酶主要用于對(duì)前者的對(duì)照試驗(yàn)或雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。目前，GFP-Luc、RFP-Luc、Luc-LacZ以及雙熒光素酶等融合報(bào)告基因被廣泛使用。

熒光素酶報(bào)告基因標(biāo)記干細(xì)胞有兩種方法，一是應(yīng)用含Luc轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的干細(xì)胞移植到正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行活體示蹤；二是應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。利用病毒載體將熒光素酶報(bào)告基因整合到預(yù)期觀察細(xì)胞的染色體上，常用的病毒載體有慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒和腺病毒[16]。其中，慢病毒載體可以長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)目的基因，是構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體的最佳選擇；而用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒構(gòu)建的方法在較長時(shí)間的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)表達(dá)熒光素酶內(nèi)的能力下降[17]；腺病毒轉(zhuǎn)染不能將報(bào)告基因整合到細(xì)胞的染色體中，限制了示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的存活和擴(kuò)增[18]。

1.2 成像原理及特點(diǎn)

每一個(gè)熒光素酶反應(yīng)后只產(chǎn)生一個(gè)光子，由于散射和吸收的影響，能到達(dá)體外且能被檢測到的光子量很少，肉眼無法觀察，因此需要一套裝置來檢測光子。該裝置主要由3部分組成：低溫成像CCD相機(jī)、成像暗箱及成像軟件。生物發(fā)光的特點(diǎn)是不需要激發(fā)光，避免了對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞的損傷，有利于長期觀察各種生物行為；由于動(dòng)物體自身不會(huì)發(fā)光，生物發(fā)光有極低的背景，檢測靈敏度很高，可檢測到102數(shù)量級(jí)的細(xì)胞；信號(hào)可以定量，從體表的信號(hào)水平直接得出發(fā)光的細(xì)胞數(shù)量；可動(dòng)態(tài)觀察體內(nèi)細(xì)胞代謝活性及其增殖、存活情況。生物發(fā)光成像（Bioluminescent imaging,BLI）輸出的為二維圖像，使用與定性分析和定量計(jì)算，但難以實(shí)現(xiàn)光源的準(zhǔn)確定位[19]；生物發(fā)光斷層成像（Bioluminescent tomography，BLT）可獲得活體小動(dòng)物體內(nèi)發(fā)光光源的精確位置信息，彌補(bǔ)了BLI在精確定位上的不足。

2 熒光素酶生物發(fā)光成像在干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

生物發(fā)光成像廣泛用于細(xì)胞凋亡[20]、蛋白質(zhì)間的相互作用[21]、免疫細(xì)胞的遷移[22]、癌癥及其藥物的研究[23-24]等多領(lǐng)域。最近幾年，這種技術(shù)開始被用于干細(xì)胞的研究中，可在活體內(nèi)觀察干細(xì)胞的行為和生物學(xué)特性及其轉(zhuǎn)歸，可以準(zhǔn)確得到活動(dòng)物體內(nèi)靶位置的干細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生存和分化情況，動(dòng)態(tài)、全面地檢測靶細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸過程，加速了干細(xì)胞在腫瘤、組織工程等領(lǐng)域中的研究，為干細(xì)胞的示蹤提供了一個(gè)有效的手段。

2.1 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞（ECs）是一種全能干細(xì)胞，具有自我更新和分化成各種類型細(xì)胞的能力。Feng等[18]觀察EC-TF（三重融合基因標(biāo)記的胚胎干細(xì)胞fluc-mrfp-ttk）移植到裸鼠的心肌，用BLI和PET進(jìn)行比較監(jiān)測。BLI信號(hào)在1～4周內(nèi)不斷增強(qiáng)，特別是在第2～3周，PET信號(hào)逐漸增高，與BLI結(jié)果呈相關(guān)性，直接表明了ECs在宿主心臟內(nèi)的存活和增殖。Li等[25]利用雙報(bào)告基因（Fluc-eGFP）比較4周內(nèi)hECs（人胚胎干細(xì)胞）與hESC-ECs（人胚胎干細(xì)胞來源的內(nèi)皮細(xì)胞）在SCID小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸。BLI信號(hào)顯示在移植的第2天，hESC-ECs-FLuc-eGFP表現(xiàn)了較強(qiáng)的信號(hào)，在隨后的時(shí)間內(nèi)逐漸減少，說明移植后的ESC-ECs細(xì)胞快速死亡；而hECs-FLuc-eGFP表現(xiàn)了不斷增強(qiáng)的信號(hào)，形態(tài)學(xué)檢測與BLI結(jié)果一致，說明ECs在體內(nèi)快速擴(kuò)增。BLI可用于縱向監(jiān)測胚胎干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體內(nèi)的生存和增殖。

2.2 骨髓來源干細(xì)胞

2.2.1 造血干細(xì)胞

對(duì)造血干細(xì)胞的研究已有多年的歷史，常規(guī)的實(shí)驗(yàn)需要犧牲大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來觀察不同時(shí)間點(diǎn)的造血干細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，無法達(dá)到實(shí)時(shí)縱向監(jiān)測移植物在活體內(nèi)的動(dòng)態(tài)遷移和歸巢的全過程，而活體示蹤的方法可以動(dòng)態(tài)、長期的觀察造血干細(xì)胞。Cao等[26]用熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植到輻射處理的小鼠體內(nèi)，早期在脾臟和骨髓中發(fā)現(xiàn)了不連續(xù)的點(diǎn)狀發(fā)光，而后點(diǎn)狀發(fā)光不斷擴(kuò)大遍布全身。在該實(shí)驗(yàn)中，BLI提供了一個(gè)有力的方法評(píng)價(jià)造血干細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為，監(jiān)測造血干細(xì)胞在活體內(nèi)的遷移與分布的過程。

2.2.2 非造血干細(xì)胞

骨髓來源的干細(xì)胞具有多向分化潛能性，可以分化成骨、軟骨、成肌細(xì)胞、神經(jīng)等[27-33]。Hara等[34]利用這一技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測MSCs在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸。在損傷部位，動(dòng)脈注射途徑產(chǎn)生的信號(hào)比肌肉注射途徑高4～5倍，雖然動(dòng)脈途徑移植的初期會(huì)有MSCs在肺部聚集的情況，但是在第2天基本消失。生物成像結(jié)果表明，動(dòng)脈注射是MSCs移植的最佳途徑。Inoue等[35]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將Luc基因轉(zhuǎn)入Lewis大鼠中，從中提取MSCsLuc和BMCsLuc，分別將兩種細(xì)胞移植到人工真皮上，修補(bǔ)頭部全層皮膚缺損的糖尿病大鼠，通過BLI觀察到MSCs停留在損傷部位的時(shí)間長于BMCs，而這一現(xiàn)象與組織學(xué)顯示損傷部位的愈合和血管數(shù)量呈正相關(guān)。Laura等[36]分別將hUVECLucGFP(人內(nèi)皮細(xì)胞)和hUVECLucGFP與hMSCs的混合物（4∶1）皮下注射到裸小鼠的腹側(cè)，觀察血管的形成過程。在細(xì)胞移植的第1天，含有hMSCs的熒光素酶活性明顯高于不含hMSCs，隨即光子信號(hào)減弱，而在14 d時(shí)信號(hào)逐漸增強(qiáng)，該過程可能與血管網(wǎng)絡(luò)建立和整合到血管床有關(guān)。在120 d的觀察中，含有hMSCs的信號(hào)穩(wěn)定，高于不含hMSCs的信號(hào)，這一結(jié)果與形成功能性血管呈正相關(guān)。Koen等[37]利用活體示蹤比較Luc/GFP轉(zhuǎn)基因小鼠不同的干細(xì)胞在心肌梗塞中的作用。BLI的數(shù)據(jù)顯示，移植后的第2天，在移植區(qū)域有較強(qiáng)的信號(hào)，說明了MSCs、ASCs（Adipose stromal cells）心肌內(nèi)移植成功，隨后信號(hào)明顯減弱，4～5周后與背景水平一致。利用BLI技術(shù)驗(yàn)證了在心臟區(qū)域移植的細(xì)胞沒有長時(shí)間的生存能力，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為GFP可能引起免疫反應(yīng)，從而影響了移植細(xì)胞在心臟區(qū)域的存活[38－39]。在該實(shí)驗(yàn)中帶有熒光素酶基因的細(xì)胞對(duì)機(jī)體影響小，安全性較好，有利于長時(shí)間的觀察細(xì)胞生物學(xué)行為。Akimoto等[40]用Luc/GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓來源細(xì)胞體外培養(yǎng)，移植到經(jīng)過輻射處理的小鼠體內(nèi)，利用LPS直接注射到海馬區(qū)域誘導(dǎo)炎癥，生理鹽水作為對(duì)照組。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中FLI的信號(hào)強(qiáng)度無明顯強(qiáng)弱改變，相對(duì)于對(duì)照組無差異，而BLI實(shí)驗(yàn)組的信號(hào)明顯高于對(duì)照組，且與免疫組化結(jié)果一致。說明BLI優(yōu)于FLI，可用于檢測到更深部的信號(hào)，是一種更好的示蹤方法。

2.3 神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞具有遷移能力，可分化成神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)也可作為細(xì)胞載體，傳送治療因子。Shah等[41]用Gil36-RL（GFP-RLuc）建立小鼠惡性膠質(zhì)瘤模型，將NPC-FL-sTRAILs移植到對(duì)側(cè)腦實(shí)質(zhì)，觀察NPC（神經(jīng)祖細(xì)胞）在體內(nèi)的遷移狀況和腫瘤的大小。BLI的結(jié)果提示，NPC跨過胼胝體移動(dòng)到腫瘤部位，且膠質(zhì)瘤區(qū)信號(hào)范圍明顯縮小。Sher等[42]利用生物發(fā)光成像技術(shù)觀察Olig2-NSCs（神經(jīng)干細(xì)胞）移植到Cuprizone模型小鼠胼胝體內(nèi)，2周內(nèi)BLI信號(hào)迅速下降，50 d后Olig2-NSCs信號(hào)僅為開始時(shí)的10%，表明大部分的細(xì)胞死亡，僅有少量的細(xì)胞存活。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)說明，BLI可以通過監(jiān)測發(fā)光點(diǎn)的范圍、光強(qiáng)度而直觀地獲得標(biāo)記的細(xì)胞在體內(nèi)的生存、分布、遷移和增殖等生物學(xué)信息。

2.4 肌肉干細(xì)胞

在肌肉干細(xì)胞的研究方面，Sacco等[43]將表達(dá)熒光素酶的MuSC（肌肉干細(xì)胞）和肌肉細(xì)胞移植到清空內(nèi)源性衛(wèi)星細(xì)胞并且肌肉損傷的NOD/SCID小鼠體內(nèi)。BLI結(jié)果表明，移植MuSC產(chǎn)生較強(qiáng)的信號(hào)，而移植肌肉細(xì)胞則幾乎檢測不到信號(hào)；組織學(xué)證實(shí)，MuSC能夠在體內(nèi)增殖、分化、修復(fù)肌肉損傷。結(jié)果表明，BLI的信號(hào)強(qiáng)度與供者來源的肌細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，BLI是一種可以量化供體細(xì)胞，動(dòng)態(tài)示蹤供體細(xì)胞在活體內(nèi)增殖的理想工具。

總之，干細(xì)胞移植在骨缺損、腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液病、缺血性疾病、肌肉損傷修復(fù)等方面[44-46]都有著廣闊的應(yīng)用前景，建立一種干細(xì)胞活體示蹤方法對(duì)了解其體內(nèi)生物學(xué)行為極其重要。生物發(fā)光成像所具有的特點(diǎn)，使它能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測干細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，評(píng)價(jià)其安全性，分析選擇適合于不同組織修復(fù)的干細(xì)胞以及移植生物材料的篩選[47－48]，為摸索最佳的干細(xì)胞移植途徑、研究干細(xì)胞在體內(nèi)復(fù)雜的生物過程提供了依據(jù)。同時(shí)，生物發(fā)光成像技術(shù)也存在一些需要改進(jìn)的地方，如進(jìn)一步優(yōu)化熒光素酶報(bào)告基因，以減少光波在體內(nèi)的吸收和散射；增加熒光素酶的組織特異性，增強(qiáng)在體內(nèi)示蹤的敏感性，使生物發(fā)光成像能更廣泛地、更深層次地應(yīng)用于干細(xì)胞領(lǐng)域的研究。

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Q786

B

1673－0364（2010）01－0052－04

2009年11月17日；

2010年1月6日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.016

上海市晨光計(jì)劃（09CG14），上海市科委科技人才計(jì)劃（08XD14025）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。