張秀峰

(青海省藥品檢驗(yàn)所，青海西寧810000)

四味雪蓮花顆粒收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》(中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)部分)內(nèi)科心系合成分冊(cè)［1］。由紅景天、雪蓮花、大黃、蕨麻四味藏族傳統(tǒng)用藥組成。藏醫(yī)用于三大因素平衡紊亂，隆，培根功能失調(diào)，氣血上升，血瘀痰阻所致的高脂血癥［1］。原標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定為高效液相色譜法測(cè)定大黃素含量，本實(shí)驗(yàn)用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大黃素、大黃酚的總量。此法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能夠更好的控制四味雪蓮花顆粒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀，Agilent G1314 VWD紫外檢測(cè)器，HP化學(xué)工作站(美國(guó)Agilent公司);電子天平(SartoriusBT224S，北京賽多力斯儀器公司);電子天平(SartoriusR200-D，北京賽多力斯儀器公司);電子天平(METTLER PB1502-S，瑞士 METTLER公司);超聲波清洗器(B2500s-MT，上海必能信超聲波清洗儀有限公司)。

大黃素對(duì)照品(110756-200110)，大黃酚對(duì)照品(110796-200412)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，為含量測(cè)定用。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水;四味雪蓮花顆粒樣品與陰性藥材由青海金訶藏藥藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，樣品批號(hào)分別為:081101、081102、081103。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:依利特Hypersil-ODS2 柱(250 mm ×4.6 mm，粒徑 5 μm);柱溫:室溫;流動(dòng)相:甲醇－0.1%磷酸溶液(80∶20);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算，大于10 000(應(yīng)不低于3 000)。

在上述色譜條件下，得到四味雪蓮花顆粒供試品及大黃素、大黃酚對(duì)照品色譜圖，大黃素的保留時(shí)間在8.5 min左右，大黃酚的保留時(shí)間在11.3 min左右。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大黃素對(duì)照品9.93 mg，大黃酚對(duì)照品27.55 mg分別置250 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;分別精密量取上述大黃素對(duì)照品溶液4 mL，大黃酚對(duì)照品溶液2 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋置刻度，搖勻即得混合對(duì)照品溶液(大黃素對(duì)照品溶液濃度為1.588 μg/mL，大黃酚對(duì)照品溶液濃度為2.204 μg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 取本品裝量差異下內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 mL，置100 mL錐形瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸液10 mL，超聲處理2 min(50 Hz，120 W)，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流 1 h，放冷，移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次約10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按照處方的組成，取除大黃外的其余藥味，按制備工藝要求制成不含大黃的制劑，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備陰性對(duì)照溶液。在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀。供試品色譜圖中，在與大黃素、大黃酚對(duì)照品色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間上，分別有相同的色譜峰，而陰性對(duì)照在此無(wú)干擾。

2.5 線性考察 分別精密吸取上述已配制好的大黃素(濃度為1.588 μg/mL)與大黃酚(濃度為2.204 μg/mL)對(duì)照品混合溶液 2、4、8、12、16、20 μL，按上述條件分別注入色譜儀測(cè)定，以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程得:大黃素Y=6.081 1X－0.104 7，r=0.999 9，大黃素進(jìn)樣量在 0.003 176～0.031 76 μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系;大黃酚Y=11.883X －0.957 8，r=0.999 9，大黃酚進(jìn)樣量在0.004 41～0.044 1 μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系。

2.6 精密度考察 精密吸取上述已配制好的大黃素對(duì)照溶液(濃度為1.588 μg/mL)，大黃酚對(duì)照溶液(濃度為2.204 μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量為10 μL，按色譜條件操作進(jìn)行，測(cè)峰面積，以峰面積計(jì)算大黃素RSD=0.3%，大黃酚RSD=0.9%，結(jié)果表明:大黃素、大黃酚測(cè)定方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào):081103)，按上述色譜條件分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣量 10 μL，測(cè)定峰面積的大黃素RSD=3.0%，大黃酚RSD=1.3%，說(shuō)明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按照上述含量測(cè)定方法對(duì)相同批號(hào)(081103)樣品制備5份供試液，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果大黃素RSD=1.6%，大黃酚RSD=1.4%，說(shuō)明本方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取大黃素2.55 mg，大黃酚4.28 mg置250 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，配制成每1 mL含大黃素為0.010 2 mg，大黃酚為0.017 10 mg的混合溶液。取已知含量的四味雪蓮花顆粒樣品(批號(hào)081103，大黃素含量為0.064 2 mg/g，大黃酚含量為0.102 9 mg/g)0.25 g，稱取9份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液1、1.5、2.5 mL各3份，按上述供試品溶液的制備方法制備，按上述色譜條件測(cè)定大黃素與大黃酚的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率大黃素為98.1%，RSD=2.1%;大黃酚為98.9%，RSD=2.3%。結(jié)果表明本方法加樣回收較好，結(jié)果見(jiàn)表1、2。

2.10 樣品測(cè)定 按上述含量測(cè)定方法，對(duì)3批樣品中所含大黃素、大黃酚的總量進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.11 原方法測(cè)定結(jié)果與改進(jìn)后方法測(cè)定結(jié)果比較 原標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果與改進(jìn)后的方法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

測(cè)定結(jié)果表明，原標(biāo)準(zhǔn)中大黃素含量低于萬(wàn)分之一，改進(jìn)后測(cè)定結(jié)果及數(shù)據(jù)均高于萬(wàn)分之一，對(duì)于制劑質(zhì)量的控制更有意義。建議將原標(biāo)準(zhǔn)中單測(cè)定大黃素含量改進(jìn)為同時(shí)測(cè)定大黃素、大黃酚的含量。

表1 大黃素回收率測(cè)定結(jié)果

表2 大黃酚回收率測(cè)定結(jié)果

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

表4 2種測(cè)定方法結(jié)果比較

3 討論

3.1 本次試驗(yàn)對(duì)大黃素和大黃酚進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，大黃素、大黃酚在254 nm和436 nm處都有最大吸收，參照2005版《中國(guó)藥典》一部［2］大黃藥材的含量測(cè)定項(xiàng)，選擇波長(zhǎng)為254 nm進(jìn)行檢測(cè)，樣品主峰分離度較好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.2 參照2005版《中國(guó)藥典》［2］一部中大黃藥材含量測(cè)定方法測(cè)定四味雪蓮花顆粒樣品，色譜峰分離度和峰形并不理想，后改用甲醇－0.1%磷酸溶液(80∶20)作為流動(dòng)相，20 min內(nèi)出峰完成，且分離度較好。

3.3 在試驗(yàn)過(guò)程中，我們考察了超聲30、45、60、75 min和回流30、45、60、75 min提取樣品中大黃素和大黃酚的含量，發(fā)現(xiàn)回流的樣品含量總體高于超聲提取，且45 min和60 min，75 min大黃素、大黃酚的含量相差不大，所以本研究回流45 min作為本次樣品的提取方式。

［1］國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編(中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)部分)內(nèi)科心系分冊(cè)［S］.2002:156-159.

［2］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:17-18.