宋澤慶 林朱艷芬 （廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,湛江 524000）

黃芪多糖對哮喘小鼠特異性免疫治療的增強作用①

目的:探討黃芪多糖（Astragalus Polysaccharide,APS）對哮喘小鼠特異性免疫治療（Specific Immune Therapy,SIT）的影響及其可能的作用機制。方法:90只4～6周齡SPF級BALB/c小鼠,隨機平均分為空白對照組、哮喘模型組、SIT治療組、APS治療組、APS和SIT單純聯(lián)合治療、APS和OVA混合液治療組等 6組;用OVA致敏,分別用SIT、APS及兩者聯(lián)合等方法治療,用1%OVA霧化吸入激發(fā);最后一次激發(fā)24小時后處死小鼠,進行BALF細胞計數(shù);HE染色觀察肺組織切片炎癥細胞浸潤程度;ELISA法檢測血清IFN-γ、IL-4。結(jié)果:SIT、APS及兩者聯(lián)合治療組肺組織炎癥細胞浸潤程度減輕,BALF中白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞數(shù)減少,血清IFN-γ水平上升,IL-4水平下降,聯(lián)合治療組比分別治療組明顯。結(jié)論:APS可增強SIT的效果,其機制可能是通過影響IFN-γ、IL-4分泌水平實現(xiàn)。

支氣管哮喘;特異性免疫治療;黃芪多糖;Th1/Th2

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種常見病、多發(fā)病,已成為全球性的社會衛(wèi)生問題,對人類的健康構成了嚴重威脅。哮喘的病理學改變以氣道嗜酸性粒細胞浸潤為主,肥大細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤為輔,以氣道炎癥誘發(fā)的氣道高反應性和氣道通氣障礙為主要臨床特征。近20多年來以慢性抗炎治療為主的治療已可以有效地通過抑制氣道炎癥來控制哮喘的臨床癥狀,但哮喘的發(fā)病率和死亡率并沒有降低,而特異性免疫治療（Specific Immune Therapy,SIT）是對過敏性哮喘進行有效病因治療的方法之一,對于IgE介導的變態(tài)反應疾病患者來說,過敏原特異性免疫治療具有很好的效果[1,2]。SIT的作用機制在于調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡。近年國內(nèi)外的研究都表明卡介苗及其衍生物可作為非特異性免疫調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)機體免疫和Th1/Th2平衡[3],與SIT聯(lián)合治療哮喘能更好地使IL-4分泌水平降低、IFN-γ分泌水平升高,將免疫應答調(diào)節(jié)為Th1細胞呈優(yōu)勢應答[4]。黃芪多糖（Astragalus Polysaccharide,APS）提取自補益中藥黃芪,可使免疫功能低下小鼠下降的IFN-γ水平提高,通過IFN-γ分泌從而抑制 IL-4表達,使Th0細胞向Th1細胞分化[5]。本研究擬觀察APS對哮喘小鼠SIT的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Ovalbumin GradeⅡ購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司,Astragalus Polysaccharide Injectable Powder購自美國泛華醫(yī)藥公司,小鼠IL-4、IFN-γELISA試劑盒購自美國Biosource生物工程公司。其余試劑均為市售分析純試劑。

1.2 實驗動物 90只 4～6周齡SPF級BALB/c小鼠,雌雄各半,體重16～20克,由廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.3 致敏、藥物干預、激發(fā)小鼠 參考張力江[6]模型制作方法,并根據(jù)本實驗做適當調(diào)整。將90只小鼠隨機分為6組,每組15只。A組:空白對照組;B組:哮喘模型組;C組:SIT治療組;D組:APS治療組;E:APS、SIT單純聯(lián)合治療組;F組:APS、OVA混合液治療組 。B、C 、D、E、F 組分別于第 1、3、5、7、9、11、13天經(jīng)小鼠腹腔及后肢內(nèi)側(cè)皮下注射輔以氫氧化鋁的OVA致敏液（0.75mg/kg）,每次腹腔0.4ml,皮下0.1m l,共0.5ml;再分別于第33、35、37天經(jīng)后肢內(nèi)側(cè)皮下注射氯化鈉注射液、SIT治療液（OVA 50 mg/kg）、APS溶液（APS 200mg/kg）、APS溶液和SIT治療液（左右后肢分別注射）、OVA與APS混合液（OVA 50 mg/kg,APS 200mg/kg）各 0.1m l;第 45 天時,以1%OVA進行霧化吸入,使小鼠暴露在OVA氣霧中30分鐘,每天1次,持續(xù)7天。A組以等量生理鹽水腹腔注射、霧化吸入和后肢內(nèi)側(cè)皮下注射。

1.4 標本制備 各組小鼠最后一次激發(fā)24小時后,腹腔注射10%水合氯醛（0.6 g/kg）麻醉,摘眼球取血液約1ml,3 500 r/min離心10分鐘,收集血清,-70℃保存?zhèn)溆?。取血后處死小?打開胸腔,結(jié)扎左肺,行氣管切開插管,用生理鹽水灌洗右肺,每次1m l,共3次,收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）,回收率大于80%。采集BALF后,剪取結(jié)扎的左肺,置10%福爾馬林溶液中。

1.5 肺組織病理學檢查 小鼠左肺組織置于10%福爾馬林溶液中固定,梯度乙醇脫水后浸蠟、包埋,5μm連續(xù)切片,進行HE染色、封片,光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.6 BALF細胞計數(shù)及血清IFN-γ、IL-4測定 BALF細胞計數(shù)采用直接計數(shù)法。細胞總數(shù)用3%乙酸溶液稀釋后進行計數(shù),嗜酸性粒細胞用丙酮-伊紅稀釋液稀釋后進行計數(shù)。用ELISA法測定血清IFN-γ、IL-4水平。

1.7 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計,對各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗,若符合正態(tài)分布且方差齊則用完全隨機設計方差分析及LSD法進行檢驗,所得結(jié)果均以±s表示;否則行秩和檢驗,所得結(jié)果用中位數(shù)±四分位間距表示。

2 結(jié)果

2.1 癥狀觀察 觀察各組小鼠霧化吸入OVA致敏液后激發(fā)反應。激發(fā)約10分鐘后小鼠開始出現(xiàn)鼻煽、呼吸加快加深、點頭呼吸、偶爾咳嗽、煩躁、前肢縮抬等表現(xiàn),取出動物可見遺留較多排泄物,提示引喘成功。激發(fā)過后,小鼠精神萎靡,毛發(fā)不順,食欲下降。各治療組小鼠精神及毛發(fā)狀態(tài)24小時內(nèi)會有所恢復,食欲較模型組好。各治療組小鼠后肢均無明顯皮膚組織損傷、潰瘍,也無癱瘓現(xiàn)象?？瞻讓φ战M一般情況良好。

2.2 肺組織病理變化 空白組為正常肺組織表現(xiàn),見圖1A。哮喘組可見支氣管管腔變形、狹窄,管壁增厚,部分脫落上皮細胞脫落,杯狀細胞明顯增多,支氣管粘膜及粘膜下層組織有大量炎性細胞浸潤,肺泡間質(zhì)增厚,其中可見多量炎性細胞,見圖1B。SIT治療組支氣管形態(tài)基本正常,支氣管粘膜及粘膜下、肺間質(zhì)可見炎性細胞浸潤,見圖1C。APS治療組可見支氣管管腔變形、狹窄,管壁增厚,肺泡間質(zhì)增厚,炎性粒細胞浸潤,但程度較 B組輕,見圖1D。單純聯(lián)合治療組和混合液治療組兩組可見支氣管管腔形狀基本規(guī)則,無明顯狹窄,支氣管粘膜及粘膜下、肺泡間質(zhì)可見少量炎性粒細胞浸潤,病變程度較輕,形態(tài)與A組接近,見圖1E、F。

圖1 OVA致敏小鼠氣道重構的病理改變（HE×200）Fig.1 The pathological changes of lung inm ice sensitized by OVA（HE×200）

表1 小鼠BALF中細胞總數(shù)計數(shù)和嗜酸細胞計數(shù)的變化（±s,×108 L-1）Tab.1 Total cell count and EOS count of BALF from the m ice（±s,×108 L-1）

表1 小鼠BALF中細胞總數(shù)計數(shù)和嗜酸細胞計數(shù)的變化（±s,×108 L-1）Tab.1 Total cell count and EOS count of BALF from the m ice（±s,×108 L-1）

Note:1）vs Control group,P＜0.01;2）vs Asthma group,P＜0.05;3）vs SIT group,P＜0.05;4）vs APS group,P＜0.05.

Groups n Total EOS Control 15 12.00±12.00 1.50±1.50 Asthma 12 44.00±29.501） 11.00±7.381）SIT 15 22.50±20.002） 4.50±4.002）APS 15 27.60±22.502） 5.50±4.502）SIT+APS 15 17.50±17.502）3）4） 2.50±2.502）3）4）SIT-APS 15 15.50±28.002）3）4） 1.50±4.002）3）4）

表2 小鼠血清IFN-γ、IL-4含量變化（±s,ng/ml）Tab.2 The levels of IFN-γand IL-4 in serum from m ice（±s,ng/m l）

表2 小鼠血清IFN-γ、IL-4含量變化（±s,ng/ml）Tab.2 The levels of IFN-γand IL-4 in serum from m ice（±s,ng/m l）

Note:1）vs Control group,P＜0.01;2）vs Asthma group,P＜0.01;3）vs SIT group,P＜0.01;4）vs APS group,P＜0.05.

Groups n IFN-γ IL-4 Control 15 127.63±17.95 34.70±7.18 Asthma 12 47.49±10.791） 54.96±9.901）SIT 15 77.81±9.871）2） 43.60±7.021）2）APS 15 74.71±6.151）2） 47.55±4.641）2）SIT+APS 15 96.15±4.721）2）3）4） 42.41±3.871）2）4）SIT-APS 15 98.17±5.051）2）3）4） 40.80±4.321）2）4）

2.3 BALF細胞計數(shù) B組炎性細胞和嗜酸細胞計數(shù)較空白組都有顯著增加;SIT組、APS組以及SIT和APS聯(lián)合治療的兩組細胞計數(shù)較哮喘組均明顯減少,SIT和APS聯(lián)合治療的兩組細胞計數(shù)較SIT和APS單獨治療組也有明顯減少,均有統(tǒng)計學意義（見表1）。

2.4 血清IFN-γ、IL-4水平 B組較A 組IFN-γ顯著降低,而IL-4顯著升高;SIT組、APS組以及SIT和APS聯(lián)合治療的兩組較哮喘組IFN-γ明顯升高,IL-4明顯降低,SIT和APS聯(lián)合治療的兩組較SIT和APS單獨治療組IFN-γ明顯升高,IL-4明顯降低（見表2）。

3 討論

本課題用OVA致敏、激發(fā)制作哮喘小鼠模型。在激發(fā)過程中可觀察到哮喘組小鼠有呼吸困難、煩躁等癥狀;肺組織病理切片可見到支氣管管腔狹窄,管壁增厚,大量炎性細胞浸潤;肺泡灌洗液中細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)比空白組明顯增多,提示模型塑造是成功的。哮喘組與空白組比較,血清中特征性Th1型細胞因子IFN-γ水平降低、特征性Th2型細胞因子IL-4水平升高,Th1/Th2比例降低,Th2細胞呈優(yōu)勢應答,Th1/Th2失衡,此結(jié)果與哮喘發(fā)生機制一致。

哮喘發(fā)生過程中,變應原通過粘膜被抗原提呈細胞如B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等識別而捕獲,發(fā)生免疫應答,在血液中和其他部位變態(tài)反應轉(zhuǎn)向選擇性Th2淋巴細胞應答,而特異性Th1淋巴細胞亞群的數(shù)量則減少,活性降低,使Th1/Th2失衡。研究證明SIT可同時作用于抗原提呈細胞和T細胞,糾正細胞因子失衡來逆轉(zhuǎn)Th1/Th2平衡失調(diào)[7,8]。本課題中,對OVA致敏的小鼠進行SIT,隨后激發(fā),也出現(xiàn)呼吸困難等癥狀,但程度比哮喘組輕;肺組織切片炎性細胞的浸潤程度比哮喘組輕;BALF中細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)也比哮喘組大大減少。SIT對哮喘有明顯的治療作用。而且,與哮喘組比較,IFN-γ明顯升高,IL-4明顯下降,提示SIT有上調(diào)Th1細胞功能和下調(diào)Th2細胞功能的作用,從而調(diào)節(jié)了Th1/Th2的失衡。

APS作為一種免疫增強劑,在臨床上已經(jīng)應用于體質(zhì)差免疫力低下的病人,并取得較好的輔助治療作用,而且其調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡文章已多有報道。因此我們試圖探究出APS對哮喘治療作用并看其是否能增強SIT對哮喘的免疫治療作用。在本課題中,從激發(fā)癥狀、肺組織病理表現(xiàn)、肺泡灌洗液細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)、以及血清IFN-γ、IL-4水平等這些方面,APS組與哮喘組的比較結(jié)果提示APS也可以通過刺激IFN-γ分泌,提高Th1應答水平,抑制IL-4分泌,降低Th2應答水平。SIT、APS聯(lián)合治療的E、F兩組,從激發(fā)癥狀、肺組織病理表現(xiàn),肺泡灌洗液中細胞計數(shù)以及血清細胞因子檢測都提示SIT、SPA聯(lián)合應用對哮喘有治療作用,且效果比單用好,證明SPA能增強SIT免疫治療作用;聯(lián)合應用與單獨應用比較,主要體現(xiàn)為上調(diào)Th1細胞功能的作用增強,但是兩種聯(lián)合的方式間沒有顯著差異。

國外一些研究證明:用生物素、親和素將卡介苗衍生物和OVA偶聯(lián)起來后可以誘導出比單獨應用更強的免疫應答效應[9]。因此,我們也可以在后續(xù)研究中,探討APS與OVA的偶聯(lián)方法,用偶聯(lián)后獲得的APS-OVA進行動物實驗觀察其效果是否能超越單純聯(lián)合應用,并探討其機制,這些可以為開發(fā)哮喘蛋白疫苗奠定理論依據(jù)。

1 Novembre E,Galli E,Landi Fetal.Coseasonal sublin-gual immunothe rapy reduces thedevelopmentofasthma in children with allergic rhinocon-junctivitis[J].JAllergy Clin Immunol,2004;114（4）:851-857.

2 張忠芳,何韶衡.變態(tài)反應疾病免疫治療機制的研究進展[J].廣東醫(yī)學,2006;27（9）:1410-1412.

3 Carcia-Marcos L,Suarez-VarelaM M,Canflanca IMetal.BCG immunization at birth and atopic diseases in ahomogeneous population of Spanish school children[J].Int A rch A llergy Immunol,2005;137（4）:303-309.

4 王成秀,符 洲,周 娟.卡介苗多糖核酸和特異性免疫治療對哮喘兒童免疫功能的影響[J].免疫學雜志,2005;21（1）:61-63.

5 顏培宇,于曉紅,張德山etal.黃芪多糖注射液對免疫功能低下小鼠血清IL-4和IFN-γ影響的實驗研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2007;10（26）:35-36.

6 張力江,陳衛(wèi)強,田 瓊etal.中藥藍玉簪顆粒對慢性哮喘小鼠氣道重建的影響及機制[J].第四軍醫(yī)大學學報,2007;28（21）:1933-1936.

7 Anals P,Karine B,Domitille Petal.A llergen-specific immunotherapy in allergic rhiniti and asthma.Mechanismsand proofof efficacy[J].RespiratoryMedicine,2009;103（6）:800-812.

8 Giovanni P,Stephen R,Durham M D.A llergic rhinitisand its impact on asthma update:allergen immunotherapy[J].JAllergy and Clinical Immunology,2007;119（4）:881-891.

9 ShirotaH,Sano k,kikuchiTetal.Regulation of T-helperType2 celland airway eosinophilia by trans mucosal coad-ministration of antigen and oligode oxynucleotides containing CpGmotifs[J].Am J Respir Cell Mol Bio,2000;22（2）:176-182.

[收稿2009-07-17 修回2009-12-07]

（編輯 倪 鵬）

The enhancement of Astragalus Polysaccharide on specific immunotherapy in asthmaticmouse

SONGZe-Qing,LINLin,ZHUYan-Fen.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicine College,Zhanjiang524000,China

Objective:To explore theeffects the of AstragalusPolysaccharideon specific immune therapy in amousemodel of asthma.Methods:Ninety SPF（Specific pathogen Free）BALB/c micewere random ly divided into six groups.The experimental groupswere sensitized with OVA,treated with SIT or APS or their joint application.Then them icewere excited with 1%OVA.24 hours after the last excition,the numbers of the total inflammation cells and esoinophils（EOS）in BALF were counted.The left lung tissueswere used to perform histological analysis.IFN-γand IL-4 in peripheral blood were analysed by ELISA.Results:After the therapy,asthma-associated lung inflammation was inhibited,and the numbers of total cells and EOS decreased.IFN-γlevelwas raised and IL-4 levelwas lowered.Conclusion:APS can enhance SIT.Itmay resu lt from affecting production of both the IFN-γand IL-4.

Asthma;SIT;APS;Th1/Th2

R392.8 R562.2+5

A

1000-484X（2010）02-0132-04

①本文為廣東省中醫(yī)藥管理局課題（No.2050013）

宋澤慶（1956年-）,男,主任醫(yī)師,碩士生導師,主要從事呼吸內(nèi)科相關疾病方面研究,E-mail:zeqingsong@yahoo.com。

·啟事·