許海龍 劉俊生

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,近年來發(fā)病率及病死率在我國呈上升趨勢。吉西他濱對膀胱腫瘤具有不錯的療效，常見的是吉西他濱聯(lián)合順鉑方案，但該方案對腎臟的損害作用限制了其在高齡及有腎功能和潛在腎功能損傷患者中的應用。國內外不少學者報道，維生素C、維生素K3對某些腫瘤細胞系的增殖具有抑制作用，并能誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。本實驗旨在觀察吉西他濱聯(lián)合維生素C和維生素K3對體外培養(yǎng)的膀胱腫瘤細胞抑制增殖和促進凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 吉西他濱（LILLY FRANCE S.A公司，注冊證號H 20050171），維生素C、維生素K3（Sigma公司，USA），RPM 1640培養(yǎng)基，小牛血清（四季青公司）。四氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），胰蛋白酶，碘化丙啶（PI），均為Sigma公司產品。流式細胞儀（B-D公司，USA，F(xiàn)ACScalibur型）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人膀胱癌T24細胞株（山西醫(yī)科大學中心實驗室提供）。培養(yǎng)液為含10％小牛血清和100U/m l青霉素、100U/m l鏈霉素的RPM I1640，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈貼壁生長，0.25％的胰酶和0.02％EDTA（1：1）消化傳代，每隔2～3天傳代一次，處于指數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。

1.2.2 藥物處理及分組 分4組：吉西他濱組；VC＋K3組；吉西他濱＋VC＋VK3組；空白對照組。MTT法篩選出前兩組藥物作用的最佳濃度?？瞻讓φ战M加入等體積培養(yǎng)液。

1.2.3 MTT檢測

（1）吉西他濱濃度的篩選 取指數(shù)生長期細胞，0.25％胰酶消化，細胞密度為5×104/孔接種于96孔板，貼壁24h后，分別加入不同濃度的吉西他濱（0.01、0.1、1、10ug/m l）,每濃度設5個復孔，空白對照組加入等體積培養(yǎng)液。藥物作用時間為72h。在試驗結束前4h,取出培養(yǎng)板，加入MTT（5g/L）20UL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上清，加入100u lDMSO,于微量板式振蕩器振蕩10m in,用酶標儀在590nm波長處讀取吸光度（A）值。

細胞生長抑制率=（對照組A 490值-實驗組A 490值）/對照組A 490值×100％。

（2）吉西他濱聯(lián)合VC＋VK3濃度的篩選 選用吉西他濱作用72h后的最佳濃度，聯(lián)合一定比例（VC：VK3＝100：1）[1]不同濃度的VC＋VK3（100：1、250：2.5、500：5、1000：10umol/L），篩選出VC+VK3的最佳濃度。準備方法和藥物處理同上。

1.2.4 流式細胞儀檢測 收集各組藥物作用72h后的T 24細胞（1.0ug/m l吉西他濱；1000：10um ol/LVC+VK3；1.0ug/m l吉西他濱＋1000：10umol/LVC+K3；空白對照組加入等體積培養(yǎng)液），使用磷酸緩沖液（PBS）清洗3次，加入冰預冷的70％乙醇4℃下固定12h以上。上機前離心棄去乙醇固定液，PBS清洗，37℃下與含10g/L RNA酶的Tris-HC l緩沖液（pH 7.4）共同培養(yǎng)30分鐘。細胞DNA染色用碘化丙錠（PI），流式細胞儀分析測定細胞凋亡及細胞周期分布，Cellquest軟件獲取熒光信號，采用Mod fit LT2.0軟件分析。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，采用析因設計資料方差分析，檢驗水準取α=0.05，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。采用spss13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。

2 結果

2.1 MTT篩選結果

（1）不同濃度吉西他濱對T 24細胞均有抑制作用，且呈濃度依賴性，結合臨床考慮10ug/m l吉西他濱毒性過大,故采用1.00ug/m l為吉西他濱最佳濃度進行以下實驗（見表1）。

（2）同一比例（VC：VK3=100：1）不同濃度的VC＋VK3與1.00ug/m l吉西他濱聯(lián)用，培養(yǎng)72h后，發(fā)現(xiàn)不同濃度的VC+VK3均增強吉西他濱對T24細胞的抑制作用，且呈濃度依賴性，其中1000：10um ol/L組的抑制最為明顯，故選用該濃度進行以下實驗（見表2）。

2.2 吉西他濱聯(lián)用VC+VK3對細胞凋亡及細胞周期分布的影響

結果顯示，作用72h后，吉西他濱聯(lián)合VC+K3組為（41.39±1.04）％,吉西他濱組為（9.23±1.08）％，VC+VK3組為（17.42±1.09）％,空白對照組細胞凋亡率為（5.92±0.76）％。各藥物組與對照組相比差異均有顯著性（P＜0.05），聯(lián)合用藥組與單藥組相比差異有顯著性（P＜0.05）（見圖1）。

表1 不同濃度吉西他濱對T24細胞增殖的抑制作用Tab1 The inhibitory effects of different concentration of gem citabine

表2 吉西他濱聯(lián)用不同濃度VC+VK3對T24細胞增殖的抑制作用Tab2 The inhibitory effects of the combination of gem citabine and VC+VK 3

表3 各組對細胞周期和凋亡的影響（％）Tab3 The influence on cell cycle and apoptosis of each group（％）

注：與對照組相比，*為P＜0.05；與吉西他濱組相比，△為P＜0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 各藥物組的細胞凋亡率Fig1 The cell apoptosis rates of each group

方差分析結果顯示，吉西他濱組的主效應有統(tǒng)計學意義，細胞凋亡率高于對照組（P＜0.05）；VC+VK3組的主效應也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；二者之間的交互效應有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。據(jù)專業(yè)知識，凋亡率越大示藥物凋亡作用越強，由表3知,聯(lián)合用藥組凋亡作用強于吉西他濱、VC+VK3單藥組，可認為吉西他濱與VC+VK3有協(xié)同作用，VC+VK3增強吉西他濱誘導人膀胱癌T24細胞凋亡的作用。表3示聯(lián)合用藥對S期阻滯作用顯著。

3 討論

膀胱腫瘤的發(fā)病率國內居泌尿系腫瘤第一位?；熓俏ㄒ荒苎娱L晚期膀胱腫瘤患者生存時間并改善其生活質量的治療方法,可使多數(shù)患者的預計生存時間由3～6個月延長至1年左右,少數(shù)病人可獲得長期生存[2]。吉西他濱是一種新型脫氧胞苷類似物,具有抗瘤譜廣、作用機制獨特、毒性反應低、與其他化療藥物無交叉耐藥且毒性反應無疊加等特點。姚旭東等研究了吉西他濱對膀胱癌細胞系增殖、細胞周期及凋亡的作用，證實吉西他濱對膀胱移行細胞癌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)細胞分化低、倍增時間短的癌細胞系對吉西他濱更敏感[3]。目前在晚期膀胱癌治療中，吉西他濱已成為化療的一線藥物,較常見的是吉西他濱聯(lián)合順鉑方案，但因為該方案的腎毒性限制了其在高齡及有腎功能和潛在腎功能損傷患者中的應用。

近年來的研究顯示,維生素C和維生素K3在治療或作為輔助藥聯(lián)合其他抗癌藥物治療惡性腫瘤方面具有潛在價值。本實驗證實了吉西他濱與VC+VK3的協(xié)同作用。維生素C作為一種抗氧化劑，在體內可以和氧自由基結合發(fā)生還原反應,清除有害的氧自由基,保護細胞的DNA免受氧化損傷；大劑量的VC還對腫瘤細胞具有抑制及殺傷作用。Mu ralik rishnan等在實驗中觀察到維生素C可抑制環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤及5-氟尿嘧啶引起的血漿脂質代謝異常,起到保護化療個體的作用[4]。Blasiak等的研究中檢測順鉑及三氧化硒造成的細胞及基因毒性,結果發(fā)現(xiàn)維生素C的保護作用,而對DNA修復的細胞動力學無明顯影響,故認為維生素C有助于減輕抗癌藥物的副作用[5]。有細胞培養(yǎng)試驗表明,低濃度的維生素C對纖維細胞瘤細胞SW 620有一定保護作用,而高劑量則對瘤細胞有殺傷作用,因維生素C對腫瘤細胞的殺傷作用和能降低抗腫瘤藥對機體的損傷而被建議作為腫瘤輔助治療藥物。維生素K3為人造的維生素K1衍生物，通過醌的氧化還原反應使體內活性氧簇（ROS）生成增多，超過細胞氧化承受能力，引起細胞死亡。維生素K3與其他維生素聯(lián)合應用引起的細胞毒作用可能與上述的氧化還原反應有關[6]。在體外實驗中，加入維生素C可以增強維生素K3的毒性，導致氧化應激的發(fā)生[7]。Noto等證實維生素C和維生素K3以100：1的比例下聯(lián)合應用時，對人類乳腺癌的抑制作用顯著增強[1]。聯(lián)用時，二者可以在低于常規(guī)10到50倍的劑量下協(xié)同作用抑制細胞生長，同時藥物毒性也相應減少了[1]。

本實驗結果顯示：聯(lián)合用藥組為（41.39±1.04）％，吉西他濱組培養(yǎng)72h后，其凋亡率為（9.23±1.08）％，與吉西他濱組相比差異有顯著性（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組誘導凋亡作用明顯高于吉西他濱組，證實維生素C和維生素K3增強了吉西他濱誘導細胞凋亡的作用。這與Kassou f等在UMUC-14等細胞中的發(fā)現(xiàn)相符[8]。

目前對維生素C和維生素K3誘導細胞死亡的明確機制仍不清楚，有待深入研究。為了探討聯(lián)合用藥誘導凋亡可能的機制，本實驗同時測得了藥物處理后的細胞周期分布，發(fā)現(xiàn)吉西他濱如其藥理學特性，主要作用于S期（46.78±3.6）％，吉西他濱聯(lián)用VC+VK3后，S期阻滯明顯增高（57.50±2.5）％，可見VC＋K3增強吉西他濱誘導T 24細胞凋亡可能與細胞周期阻滯于S期有關，其進一步機制有待深入研究。本實驗證實，VC+VK3增強吉西他濱對膀胱腫瘤T24細胞增殖抑制和凋亡誘導作用。其機制可能包括維生素的氧化還原作用形成H2O2、氧化應激、DNA損傷和細胞膜損傷,在其過程中一些關鍵性蛋白的磷酸化水平改變導致的細胞核因子κB（NF-κB）的活化抑制是細胞內主要信號轉導路徑。在Bach leitner-Hofmann等用維生素C和三氧化二砷（As2O3）共培養(yǎng)急性前髓細胞性白血病（APL）細胞的實驗中,發(fā)現(xiàn)維生素C并不是抗腫瘤細胞凋亡,而是協(xié)同A s2O3誘導APL細胞凋亡[9]。Verrax等研究也表明維生素C能協(xié)同維生素K3殺傷腫瘤細胞,并指出主要是因為能激活腫瘤細胞死亡所需的酸性或堿性DNase,從而促進腫瘤細胞凋亡或死亡[7]。同時該研究中還觀察到一種新型的細胞死亡類型，自凋亡（auto sch izis）[7,10]。Gilloteaux等將維生素C與維生素K3同加入培養(yǎng)的膀胱癌細胞系T24中,也觀察到這種不同于凋亡的死亡類型[11]。

綜上所述，本實驗表明吉西他濱聯(lián)合維生素C和維生素K3協(xié)同作用于人膀胱癌T 24系細胞增殖，VC+VK3增強吉西他濱誘導腫瘤細胞凋亡的作用，為臨床聯(lián)合用藥提供了依據(jù)和指導。

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