王孝會(huì)，王桂玲

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

GST/RIPX融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸埃希菌中的表達(dá)

王孝會(huì)，王桂玲

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

目的 構(gòu)建GST/RIPX融合蛋白基因表達(dá)載體，并在大腸埃希菌（E.coli）中誘導(dǎo)表達(dá)。方法 以質(zhì)粒pcDNA3.1-RIPX為模板，通過BamH1和Xho1酶切位點(diǎn)將RIPX定向插入pGEX-4T-2中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-RIPX，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選陽性重組子，限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列測(cè)定正確后，轉(zhuǎn)入化E.coliBL21中，異丙基硫代β-D半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定。結(jié)果 酶切及測(cè)序結(jié)果證明，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-RIPX，并用SDS-PAGE方法證實(shí)了GST/RIPX融合蛋白的表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建了RIPX原核表達(dá)載體，并證實(shí)了融合蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步純化RIPX蛋白和研究RIPX的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

質(zhì)粒；原核表達(dá)；融合蛋白；RIPX

RIPX（Rap2interaction protein X） 又名 KIAA0871，屬于KIAA基因家族成員，人的RIPXcDNA全長(zhǎng)為4304bp，ORF全長(zhǎng)為1460bp，編碼蛋白為469氨基酸。該蛋白含有一個(gè)RUN結(jié)構(gòu)域，在腦組織中存在高表達(dá)，與神經(jīng)軸突形成相關(guān)［1］。RIPX同源蛋白包括Rap2相互作用蛋8（RPIP8）和Rap2相互作用蛋白 9（RPIP9）［2，3］。該蛋白家族能夠通過與Rap和Rab家族蛋白相互作用而影響相關(guān)通路［3～5］，但目前其具體作用方式及其產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)還不明確。

為了進(jìn)一步研究RIPX的功能及具體作用機(jī)制，我們利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了RIPX的原核表達(dá)載體，將其導(dǎo)入E.coliBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)一步對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，為今后研究RIPX的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存，原核表達(dá)載體pGEX-4T-2購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；各種限制性內(nèi)切酶﹑電泳凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TakaRa公司；T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自MBI公司，異丙基硫代-D半乳糖苷（IPTG）為Amresco公司產(chǎn)品。DNA測(cè)序由南京金斯瑞公司完成。

1.2 RIPX原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pcDNA-RIPX載體用Xho1和Bam1雙酶切后，凝膠回收純化產(chǎn)物后，與經(jīng)同樣酶切處理的原核表達(dá)載體p GEX-4T-2用T4-DNA連接酶連接16℃過夜，得到連接產(chǎn)物。取5ul上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，涂布于含氨芐西林的LB瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落接種于氨芐西林3ml的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩過夜。用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，用Xho1和Bam1雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，并送生物公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序正確后，將構(gòu)建質(zhì)粒命名為GST-RIPX。

1.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒p GEX-4T-2-RIPX轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21涂布于LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。各挑取單菌落5個(gè)，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，利用BamN1和Xho1雙酶切后鑒定陽性克隆。將陽性克隆接種到含氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。

1.4 SDS-PAGE凝膠分離

將過夜培養(yǎng)含陽性克隆的菌液按1∶100稀釋，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6左右時(shí)，加入終濃度1mmol/L的IPTG30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3h時(shí)，收集菌體，加入 100μl 1×SDS緩沖液中，100℃加熱 5min，12000r/min離心5min，冰上放置，取上清進(jìn)行10%SDSPAGE電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色，脫色后觀察電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)3h即可達(dá)到理想效果。

1.5 Western blot分析

將上述誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離，恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4℃過夜，用5%脫脂奶粉封閉3h，TBST洗膜10min 3次，加入GST抗體（Cell Signaling 公司，1∶2000），室溫 1.5h，TBST洗膜10min 3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000） 室溫 2h，TBST洗膜 10min 3次，ECL顯色，壓片。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-RIPX重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-RIPX經(jīng)Xho1和BamH1雙酶切后得到約4.9kb和1.5kb左右的兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1），并經(jīng)測(cè)序鑒定正確，無移碼突變。

2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-RIPX及空載體pGEX-4T-2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中，挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用10%的SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，其中重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-RIPX在70kDa附近出現(xiàn)一明顯的特異性蛋白帶，其分子量與預(yù)期相符（圖3）。

2.3 Western blot分析純化后GST-RIPX融合蛋白

圖1 pGEX-RIPX重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Restrictin enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pGEX-RIPX

圖2 pGEX-RIPX重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定結(jié)果Fig.2 The sequencing result of the recombinant plasmid pGEXRIPX

圖3 SDS-PAGE分析GST-RIPX蛋白在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 SDS-PAGEanalysis of the induction expression of GSTRIPXfusion proteins in E.coliBL21

我們利用10%SDS-PAGE電泳后，經(jīng)Western blot分析，利用GST單克隆抗體檢測(cè)，結(jié)果可見在分子量為70kDa附近出現(xiàn)條帶，分析為質(zhì)粒本身的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）分子量（26kDa）和RIPX分子量之和，說明表達(dá)了GST-融合蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致。

3 討論

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，對(duì)未知蛋白質(zhì)的鑒定和功能研究已經(jīng)成為后基因組計(jì)劃的主要研究?jī)?nèi)容。RIPX是近年來發(fā)現(xiàn)和克隆的人類基因，又名KIAA0871，屬于KIAA基因家族成員。因其編碼的蛋白與Rap和Rab家族中GTP酶功能相關(guān)的蛋白有相同的結(jié)構(gòu)域，RIPX可能在Ras-like GTPase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要的作用［6］。

圖4 GST-RIPX融合蛋白經(jīng)純化后SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色分析Fig.4 SDS-PAGEanalysis of GST-RIPXfusion protein

為了進(jìn)一步研究RIPX的生物學(xué)功能，構(gòu)建RIPX的原核表達(dá)載體是關(guān)鍵之一。在本研究中，我們成功構(gòu)建了RIPX原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過純化，我們獲得了原核表達(dá)的GST–RIPX融合蛋白。在進(jìn)行原核細(xì)胞表達(dá)時(shí)，目前多以融合蛋白為表達(dá)形式的載體，這樣既有利表達(dá)蛋白的純化，又可防止宿主菌蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解，保護(hù)目的蛋白的活性。表達(dá)的融合蛋白進(jìn)一步可通過谷胱甘肽Beads結(jié)合吸附，從而獲得原核表達(dá)的目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果將為進(jìn)一步尋找RIPX新的相互作用蛋白，探討其生物學(xué)功能及具體機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

［1］Mori T，Wada T，Suzuki T，Kubota Y，et al.Singar1，a novel RUNdomain-containing protein，suppresses formation of surplus axons for neuronal polarity［J］.JBiol Chem，2007，282（27）：19884-19893.

［2］Janoueix-Lerosey I，Pasheva E，de Tand MF，et al.Identification of a specific effector of the small GTP-binding protein Rap2［J］.Eur JBiochem，1998，252（2）：290-298.

［3］Wang S，Zhang Z，Ying K，et al.Cloning，expression，and genomic structure of a novel human Rap2interacting gene （RPIP9）［J］.Biochem Genet，2003，41（1-2）：13-25.

［4］Kukimoto-Niino M，Takagi T，Akasaka R，et al.Crystal structure of the RUNdomain of the RAP2-interacting protein x［J］.Biol Chem，2006，281（42）：31843-31853.

［5］Yoshida H，Okumura N，Kitagishi Y，et al.Rab5（Q79L） interacts with the carboxyl terminus of RUFY3［J］.Int JBiol Sci，2010，6（2）：187-189.

［6］Zhao AG，Li T，You SF，et al.Effects of Wei Chang An on expression of multiple genes in human gastric cancer grafted onto nude mice［J］.World JGastroenterol，2008，14（5）：693-700.

（編輯 孫憲民，英文編輯 趙傳勝）

Reconstruction of pGEX-4T-2-RIPXand Its Expressions inE．coli

WANGXiao-hui，WANGGui-ling
（Department of Cell Biology，The Key laboratory of Cell Biology，Ministry of Public Health of China，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang110001，China）

Objective To construct GST/RIPXfusion protein expression vector and induce its expression in Escherichia coli（E.coli）.MethodsThe coding sequence of RIPXwas amplified from the plasmid pcDNA3.1-RIPXby PCRand inserted into pGEX-4T-2by BamHIand Xho1.The positive recombinants were identified by restriction endonuclease digestion and DNAsequencing.Then they were transformed into E.coli BL21，induced by IPTGand identified by SDS-PAGE.ResultsEnzyme digestion and DNAsequencing results indicated that the prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-2-RIPXwas successfully constructed and confirmed.The desired GST/RIPXfusion protein was detected by SDS-PAGE.ConclusionThe prokaryotic expression plasmid of RIPXis successfully constructed and the expression of fusion proteins is confirmed.This study provides the basis for the further purification of RIPXand research on the biological function of RIPX.

plasmid；prokaryotic expression；fusion protein；RIPX

Q257

A

0258-4646（2010）12-0987-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30871294）

王孝會(huì)（1987-），男，碩士.

王桂玲，E-mail：wanggl@mail.cmu.edu.cn

2010-09-28