何 琳，王祿增，鄭志紅

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部 遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001）

腫瘤是人類最常見(jiàn)的一種多基因、多因素復(fù)雜疾病，其發(fā)生是由于細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖。以往研究顯示原癌基因和抑癌基因的表達(dá)異常對(duì)腫瘤發(fā)生起著非常重要的作用，近年來(lái)隨著生命科學(xué)的進(jìn)展發(fā)現(xiàn)有些腫瘤組織中較少甚至完全沒(méi)有基因突變，而m iRNA表達(dá)卻存在異常。有關(guān)m iRNA的研究，為更全面深入的了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路。

Dicer是miRNA形成過(guò)程中必須的酶。在細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄成miRNA原初轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNA），pri-miRNA在一種被稱作 Drosha的RNA酶的作用下，剪切為長(zhǎng)度約70個(gè)核苷酸的前體m iRNA（pre-m iRNA）［1］。pre-m iRNA在Ran-GTP依賴性核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 exprotin-5的作用下，從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中［2，3］，最后在Dicer酶作用下剪切為含有20-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈miRNA，然后雙螺旋解旋，miRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）中形成非對(duì)稱RISC復(fù)合物而發(fā)揮剪切或抑制翻譯的作用［4］。由此推測(cè)，Dicer基因表達(dá)異常時(shí)可能會(huì)引起某些m iRNA表達(dá)異常從而引起細(xì)胞或組織異常增生，甚至導(dǎo)致腫瘤的形成。為此，作者將Dicer基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胚肺細(xì)胞（HELF），制作Dicer基因高表達(dá)的細(xì)胞模型，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HELF細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的變化來(lái)分析Dicer基因在腫瘤發(fā)生中所行使的功能。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也為進(jìn)一步建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型及在動(dòng)物水平對(duì)Dicer基因功能進(jìn)行研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pcDNA3.1質(zhì)粒、pcDNA3.1—Dicer質(zhì)粒、HELF細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine reagent（Invitrogen）、G418、Trizol （Invitrogen）、RT-PCR 試 劑 盒（Promege）、兔抗人 Dicer多克隆抗體（Imgenex）、MTT（華美公司）、Transwell小室（Falcon）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：用含 10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)HELF細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞處于增殖期時(shí)，以3×105細(xì)胞/孔的密度平鋪于6孔板培養(yǎng)皿上，繼續(xù)培養(yǎng)20～24 h，細(xì)胞約長(zhǎng)滿孔板底部90％時(shí)，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒 pcDNA3.1-Dicer、pcDNA3.1（空載體）分別轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞，按照Lipofectamine plus試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行1：7傳代，然后加入G418進(jìn)行篩選，每3 d換液1次，約10 d后，可見(jiàn)細(xì)胞呈單克隆狀生長(zhǎng)，挑取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞單克隆各100個(gè)接種于24孔板中，進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 Dicer基因嵌合情況：酚氯仿法提取細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行PCR檢 測(cè)，PCR 引 物 序 列：上 游 5′-GGCATT GGGAAGAATCAGCC-3′下 游 5′-ATTGATGTGTC CAATGGCCC-3′，PCR反應(yīng)條件如下：95℃ 5 m in，94℃ 1 m in，60℃ 1 m in，72℃ 1 m in，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.3 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PCR陽(yáng)性Dicer基因表達(dá)情況：提取PCR陽(yáng)性的細(xì)胞總RNA，并用DNA酶處理總RNA；瓊脂糖凝膠電泳確定RNA未降解，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，取1μg RNA，按照RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物：上游5′-GGCATTGGGAAGAATCAGCC-3′ 下 游 5′-ATTGATGTGTCCAATGGCCC-3′，PCR反應(yīng)條件如下：95℃5 m in，94℃1 m in，60℃1 m in，72℃1 m in，從第二步開(kāi)始循環(huán)30次，最后72℃延伸10 m in，產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Dicer基因的表達(dá)。1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Dicer基因蛋白表達(dá)情況：取正常 HELF細(xì)胞和 pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-Dicer轉(zhuǎn)然組RT-PCR陽(yáng)性細(xì)胞各一株分別分別提取細(xì)胞總蛋白，培養(yǎng)細(xì)胞加入含有蛋白質(zhì)酶抑制劑的蛋白裂解液1 m L/瓶，冰上裂解30 min，12 000 r/m in，4℃離心40 m in，吸取上清即為細(xì)胞總白質(zhì)。取總蛋白150μg/孔（20μL），沸水煮10 m in，室溫冷卻15 m in，7％SDS-PAGE分離總蛋白，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（1∶2000稀釋的兔抗人Dicer）置搖床上4℃震蕩孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗（1：2000）置搖床上室溫震蕩孵育2 h，ECL顯色，曝光于X光片上。掃描計(jì)算灰度值。

1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Dicer對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常HELF細(xì)胞和 pcDNA 3.1轉(zhuǎn)染組、pcDNA 3.1-Dicer轉(zhuǎn)染組陽(yáng)性細(xì)胞，以每孔3000個(gè)細(xì)胞分別接種于96孔板中，分別在培養(yǎng)24、48、72、96 h后加入MTT溶液（終濃度為5 mg/m L），37℃、孵育 4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜 150 μL/孔，置振蕩儀上低速震蕩10 m in，以培養(yǎng)液調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm的光吸收值。每組設(shè)8個(gè)孔，共重復(fù)3次。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Dicer對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響：將pcDNA3.1-Dicer轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的 HELF細(xì)胞各100 m L（約2.5×104個(gè)細(xì)胞），加入Transwell系統(tǒng)的上層小室，下室加入含有10％FBS的DMEM 600μL作為趨化因子，置于5％CO2孵箱中、37℃條件下培養(yǎng)22 h，鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞已大部分穿過(guò)人工基底膜。取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦掉上層小室側(cè)未侵襲過(guò)去的細(xì)胞，將濾膜用4％多聚甲醛固定15 min，蘇木素染核，于100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒 pcDNA3.1-Dicer和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞G418篩選后各挑取100個(gè)克隆，分別提取細(xì)胞基因組DNA，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組9（9/100）個(gè)陽(yáng)性克隆未能擴(kuò)增出 Dicer基因片段，而 pcDNA3.1-Dicer轉(zhuǎn)染組6（6/100）個(gè)單克隆成功擴(kuò)增出487 bp目的基因片段（圖1），說(shuō)明PCR結(jié)果初步鑒定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒已嵌合于HELF細(xì)胞。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

提取PCR陽(yáng)性的各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株總RNA，以反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，pcDNA 3.1轉(zhuǎn)染組未能擴(kuò)增出 Dicer基因片段，而 pcDNA 3.1-Dicer轉(zhuǎn)染組有4個(gè)細(xì)胞株成功擴(kuò)增出487 bp的目的基因片段（圖2），說(shuō)明Dicer基因已成功轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞。

2.3 W estern檢測(cè)結(jié)果

Western 印跡分析顯示與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的 HELF細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染 pcDNA 3.1-Dicer質(zhì)粒的HELF細(xì)胞中 Dicer蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，其分子量大小約200 kD（圖3）。各組之間表達(dá)差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：轉(zhuǎn)染空載體 pcDNA 3.1的HELF細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-Dicer質(zhì)粒的HELF細(xì)胞之間比較P＜0.05；轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的HELF細(xì)胞與正常HELF細(xì)胞之間比較P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4 M TT檢測(cè)結(jié)果

圖1 Dicer DNA在轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of Dicer DNA in the transfected HELF cells

圖2 Dicer mRNA在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCR陽(yáng)性HELF細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of Dicer mRNA in the stably transfected HELF cells

表1 三組細(xì)胞在不同時(shí)間MTT光吸收值的描述性統(tǒng)計(jì)Tab.1 Descriptive statistics of MTT optical absorbance at different times among the cells of the three groups

圖3 Western blot檢測(cè)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞中Dicer蛋白表達(dá)Fig. 3 The Dicer protein expression detected by Western blot

轉(zhuǎn)染 pcDNA 3.1-Dicer質(zhì)粒的 HELF細(xì)胞的MTT光吸收值在48、72、96 h顯著高于 pcDNA 3.1空載體組（P＜0.05），提示將pcDNA 3.1-Dicer質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HELF后，使HELF細(xì)胞生長(zhǎng)率逐漸增加，說(shuō)明Dicer基因表達(dá)水平上調(diào)能使HELF細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度加快（圖4，表1）。

圖4 三組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的MTT光吸收值檢測(cè)細(xì)胞增殖變化趨勢(shì)的差異Fig.4 The MTT optical absorbance at different times to detect the proliferation trend in cells of the three groups

2.5 T rans-well檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-Dicer質(zhì)粒的 HELF細(xì)胞比轉(zhuǎn)染空載體pcDNA 3.1的HELF細(xì)胞和普通HELF細(xì)胞穿透人工重構(gòu)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多（圖6，見(jiàn)彩插4），用平均穿膜細(xì)胞數(shù)標(biāo)化成相對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖（圖5）。由圖5可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-Dicer質(zhì)粒的HELF細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為198.5±4.75，而未轉(zhuǎn)染組 HELF細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體 pcDNA3.1的HELF細(xì)胞分別為27.50±6.30和26.88±5.24，質(zhì)粒 pcDNA3.1-Dicer轉(zhuǎn)染的 HELF細(xì)胞與空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的HELF及HELF細(xì)胞比較，穿膜細(xì)胞數(shù)有顯著增多。轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-Dicer組與未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染體空載體pcDNA3.1組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of Transwell chamber assay

Dicer是 RNAⅢ家族的成員之一，其定位在14q32.13，主要存在于細(xì)胞質(zhì)，是 miRNA成熟所必需的酶。Dicer與其酶切產(chǎn)物之一miRNA及其他蛋白質(zhì)形成核酸蛋白復(fù)合物在多種生物過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、死亡等。有研究發(fā)現(xiàn)許多疾病的形成尤其是腫瘤的發(fā)生與 Dicer基因表達(dá)異常密切相關(guān)。研究顯示，在有些腫瘤組織中Dicer基因起到抑癌基因的作用，其表達(dá)水平下調(diào)，如：在非小細(xì)胞肺癌中Dicer基因表達(dá)水平下調(diào)，引起let-7表達(dá)下調(diào)，并與預(yù)后正相關(guān)［5，6］；在卵巢癌中Dicer基因表達(dá)水平下調(diào)［7］。有些腫瘤組織中Dicer基因起到原癌基因的作用，其表達(dá)水平上調(diào)，如：在肝癌和前列腺癌中 Dicer基因表達(dá)水平上調(diào)［8，9］。

根據(jù)前人研究結(jié)果可以看出Dicer基因在不同的腫瘤中表達(dá)水平不一致。為了進(jìn)一步了解 Dicer基因表達(dá)上調(diào)在腫瘤細(xì)胞異常增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制，我們應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法制備了Dicer基因高表達(dá)的細(xì)胞模型。通過(guò)用MTT實(shí)驗(yàn)繪制生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 pcDNA 3.1-Dicer質(zhì)粒的HELF細(xì)胞較轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的HELF細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快（P＜0.05），說(shuō)明Dicer基因表達(dá)增加能使HELF細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度加快，提示Dicer基因表達(dá)增加可能會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生惡性轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)；同時(shí)本研究將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和正常細(xì)胞分別接種于Transwell小室的上室，通過(guò)在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿過(guò)人工重構(gòu)基底膜的細(xì)胞數(shù)測(cè)定HELF細(xì)胞遷移能力的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 pcDNA 3.1-Dicer質(zhì)粒的HELF細(xì)胞比轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的HELF細(xì)胞和普通HELF細(xì)胞穿過(guò)人工重構(gòu)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05），說(shuō)明Dicer基因的表達(dá)增加能使HELF細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力有所增強(qiáng)，這些與以往的報(bào)道是一致的。有研究顯示Dicer基因定位在人染色體14q32.13，而這一位點(diǎn)正是最常見(jiàn)的引起肺腺癌的突變位點(diǎn)［10］，當(dāng) Dicer基因表達(dá)增加時(shí)，引起該位點(diǎn)突變，從而引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化：使細(xì)胞增值速度加快，侵襲和遷移能力增加。還有研究顯示Dicer的酶切產(chǎn)物之一m iRNA與人類腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，在 B細(xì)胞淋巴細(xì)胞瘤中 Dicer基因表達(dá)增加，引起miR-17-92簇 miRNA經(jīng)常被擴(kuò)增，He和 O’Donnell等人［11］發(fā)表的論文描述：在 B細(xì)胞淋巴瘤中常常有13q31位點(diǎn)的擴(kuò)增，而在這一擴(kuò)增區(qū)域的唯一基因就是 Cl3orf25。Cl3orf25基因的第3內(nèi)含子編碼一個(gè)非編碼蛋白的RNA基因，m iR-17-92。He分析了具有13q31擴(kuò)增的細(xì)胞系的191個(gè)miRNAs，發(fā)現(xiàn)其中有6個(gè)miRNAs的表達(dá)增加，其中5個(gè)屬于miR-17-92基因簇，研究還發(fā)現(xiàn)許多B細(xì)胞淋巴瘤組織 miRNA-17的前體表達(dá)增加，并且他們通過(guò)對(duì)比過(guò)表達(dá)Myc和miR-17-92miRNA基因的淋巴瘤與僅有Myc過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者具有更強(qiáng)的增殖能力，說(shuō)明 m iR-17-92m iRNA簇的過(guò)表達(dá)與 Myc協(xié)同作用加快了腫瘤的發(fā)生。以上研究結(jié)果也說(shuō)明Dicer基因表達(dá)增加，引起具有癌基因功能的miRNA表達(dá)上調(diào)可能是腫瘤形成的原因之一。但Dicer基因具體的作用機(jī)制尚不十分清楚，為此我們將在轉(zhuǎn)基因小鼠的動(dòng)物模型上進(jìn)一步對(duì) Dicer基因的功能及作用機(jī)制進(jìn)行研究。

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