劉 雯， 謝生榮， 戚建平， 孫紅爽， 傅繼華， 平其能

(中國藥科大學(xué)，江蘇南京211100)

舒胸片(Shuxiong Tablet，SXT)處方由三七、紅花、川芎三味中藥組成，具有活血、祛瘀、止痛等功效，臨床上主要用于冠心病、心絞痛、心律失常等疾病的治療。我們根據(jù)舒胸片有效成分各自在藥材中的含量及舒胸片中各味藥材的比例［1-3］，組合成舒胸片有效成分組(Shuxiong Tablet effective compounds group，SECG)，包含三七總皂苷(Panax notoginsenosides，PNS)，羥基紅花黃色素A(hydroxysaffloryellowA，HSYA)，川芎揮發(fā)油(volatile oil of Rhizoma Chuanxiong，CVO)和阿魏酸(Ferulic Acid，F(xiàn)A)。前期研究表明，SXT與SECG在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗凝血、抗血栓和心肌保護(hù)等方面的作用效果相同并具有相同的量效關(guān)系，提示SECG有可能代替SXT應(yīng)用于治療。

微乳(ME)是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)?shù)谋壤园l(fā)形成的一種透明或半透明的、低黏度、各相同性且熱力學(xué)穩(wěn)定的溶液系統(tǒng)，是一種新型給藥系統(tǒng)。本研究將SECG制成微乳劑型(Shuxiong Microemulsion，SME)，通過 SECG 和SME在抗炎、抗凝血、活血化瘀和心肌保護(hù)作用方面的比較研究，探討進(jìn)一步提高舒胸片有效成分組藥效作用的可行性。

1 材料與動物

1.1 劑量設(shè)置

根據(jù)前期研究SECG給藥量設(shè)定［4］，SECG小鼠給藥量取30.9 mg/kg，其中:PNS 19.5 mg/kg，HSYA 6.0 mg/kg，CVO 3.0 mg/kg，F(xiàn)A 2.4 mg/kg;大鼠給藥量取 20.5 mg/kg，其中:PNS 12.9 mg/kg，HSYA 4.0 mg/kg，CVO 2.0 mg/kg，F(xiàn)A 1.6 mg/kg。

已制備的含藥微乳中有效成分組的含量為14.12%折算為SME給藥量為218.80 mg/kg，取中劑量的2倍及1/2倍為高、低劑量;大鼠給藥中劑量取 20.5 mg/kg(含 PNS 13.0 mg，HSYA 4.0 mg，CVO 2.0 mg，F(xiàn)A 1.6 mg)，折算為 SME給藥量為146.3 mg/kg，取其2倍及1/2倍為高、低劑量。阿司匹林給藥量取200 mg/kg。

1.2 主要試劑

PNS，云南昆明制藥股份有限公司產(chǎn)品;HSYA，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心;CVO，江西吉水同仁天然藥用油廠產(chǎn)品;FA，中國國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品;含藥微乳，中國藥科大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室提供，為油包水型(W/O);阿司匹林片，南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品;Miglyol 840，德國sasol公司，批號:040416;一抗 Mouse polyclonal anti NF-(SC-8008，65kD)購自美國Santa Cruz公司，1:500;二抗IRDyeTM800-conjugated aiti-Mouse IgG購自美國Rockland公司，1:10 000。

1.3 主要儀器

T6紫外可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);FA1004型電子天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司;SC—2000血小板聚集儀，北京賽科希德科技發(fā)展有限公司;半干式轉(zhuǎn)膜槽:美國Biorad公司;6131型核酸、蛋白質(zhì)含量測定儀:德國Eppendorf公司;Odyssey近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，美國LI-COR公司。

2 方法

2.1 小鼠角叉萊膠足趾腫脹試驗(yàn)

昆明種小鼠60只，♀♂各半，隨機(jī)分為6組，即模型組，陽性對照組，SECG組，SME高、中、低劑組。每天灌胃給藥1次，給藥體積為0.25 mL/10 g。連續(xù)給藥4 d。末次給藥前禁食12 h，末次給藥后1 h，在小鼠的右后足皮下注射1%角叉菜膠0.03 mL，4 h后剪下雙足，稱重，并計(jì)算腫脹率。將致炎足充分剪碎，于2 mL生理鹽水中浸泡過夜，3 000 r/min離心5 min，取上清液，于278 nm處測吸光度(A)，以吸光度與足重(g)比值作為PGE2含量。

2.2 小鼠凝血時(shí)間試驗(yàn)

劑量設(shè)置、分組、給藥方法及禁食處理，參照方法2.1項(xiàng)。給藥1 h后，毛細(xì)血管眼眶取血，測定凝血時(shí)間。

2.3 大鼠動靜脈旁路血栓試驗(yàn)

SD大鼠40只，♀♂各半，隨機(jī)分為5組:對照組，SECG組、SME高、中、低劑量組。每天灌胃給藥1次，連續(xù)14 d，第13天給藥后禁食12 h過夜，次日給藥40 min后，腹腔注射烏拉坦(10 mg/kg)麻醉，分離右頸總動脈和左頸外靜脈，以生理鹽水液充滿聚乙稀管，管中預(yù)先放入一段約4 cm長的一號手術(shù)絲線，開放動脈夾，立即開始計(jì)時(shí)，使血流通15 min后中斷血流，取出絲線稱血栓濕重，計(jì)算各組血栓抑制率并與對照組比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以血栓濕重和血栓抑制率表示。血栓濕重=(血栓+絲線重量)-絲線重量;血栓抑制率=(對照組血栓重-給藥組血栓重)/對照組血栓重×100。

2.4 大鼠血瘀證模型試驗(yàn)

SD大鼠56只，♀♂各半，隨機(jī)分為7組，分別為對照組、模型組、阿司匹林組、SECG組、SME高、中、低劑量組。灌胃給藥14 d，每天1次，給藥的第13天按照文獻(xiàn)方法［5］采用皮下注射腎上腺素(Adr)方法造血瘀模型，造模后禁食12h過夜，次日清晨給藥后40min，乙醚麻醉，腹主動脈取血4.5 mL至3.8%0.5 mL枸櫞酸鈉抗凝管中，800 r/min 10 min，吸取黃色上清液，為富含血小板血漿(PRP);剩余液體再3 000 r/min 8 min，吸取上清液為貧血小板血漿(PPP)。使用血小板聚集儀，測定血小板聚集率。

2.5 大鼠心肌缺血再灌注試驗(yàn)

動物分組與2.4項(xiàng)相同。灌胃給藥1次/d，連續(xù)14 d，末次給藥后40 min，大鼠經(jīng)腹腔注射20%戊巴比妥(45 mg/kg)麻醉后，切開氣管進(jìn)行人工機(jī)械通氣(呼吸頻率60次/min，潮氣量1.2 L/kg)，沿胸骨左緣第四肋骨間開胸，參照文獻(xiàn)方法［6］，建立左冠狀動脈前降支結(jié)扎-開放心肌缺血-再灌注模型。

(1)生化指標(biāo)的測定:頸動脈取血按照試劑盒說明分別測定血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，按照說明書使用放免法測定腫瘤壞死因子(TNF-α)。

(2)心肌梗死面積的測定:取出心臟，切片，TTC磷酸鹽緩沖液染色，10%甲醛固定24 h，呈深紅色區(qū)域?yàn)榉侨毖獏^(qū)，而未被TTC染色的白色區(qū)域代表梗死區(qū)。沿著不同顏色的邊緣切下不同區(qū)域并稱重，分別以心肌梗死區(qū)重量(infarct weight，IW)占左室重量(weight of left ventrieular，WLV)的百一分比(IW/WLV)%、(WR/WLV)%反映心肌梗死范圍。

(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR):取心肌缺血再灌注區(qū)域的心臟組織，按異硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取總RNA。用核酸、蛋白質(zhì)含量測定儀檢測濃度及純度，并將mRNA調(diào)至1 g/L，-70℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中大鼠TNF-α的cDNA引物序列為，上游:5′-GGCTGTACCTTATCTACTCC-3′，下游:5′-TGACTCCAAAGTAGACCTGC-3′，cDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為300 bp;內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的 cDNA引物序列為，上游:5′-GGTGCTGAGTATGTCGTGGA-3′，下 游:5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′，cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物長度為356 bp。上述目的cDNA的PCR擴(kuò)增條件為:分別經(jīng)過94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1 min熱循環(huán)，循環(huán) 30輪，終止延伸 72℃5min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)束后于全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，并計(jì)算各組相對灰度值(計(jì)算公式:相對灰度值=各組對應(yīng)泳道灰度值/對應(yīng)泳道GAPDH灰度值)。

(4)免疫印跡分析(Western blot analysis):采用參考文獻(xiàn)方法［7］提取核蛋白，各樣本取定量核蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，分離的核蛋白隨后通過Biorad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)電轉(zhuǎn)印30 min至PVDF膜，膜在封閉液中(10%脫脂奶粉溶于Tris鹽水緩沖液-PBS定容)37℃作用1 h封阻非特異性結(jié)合。一抗用PBST(PBS 990 mL-1%Tween-20 10 mL)稀釋至工作液濃度，1 500 μL/條，37℃恒溫?fù)u床反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，用 PBST清洗3次，每次10 min。用PBST稀釋二抗至工作液濃度，1500 μL/條，37℃恒溫?fù)u床反應(yīng)1 h(避光)。PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，每次10 min。用Odyssey近紅外熒光掃描儀掃描進(jìn)行定量分析。

2.6 結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 小鼠角叉萊膠足趾腫脹

試驗(yàn)結(jié)果表明，SECG組及SME的高、中劑量組均可以抑制角叉萊膠導(dǎo)致的小鼠足趾腫脹，顯著提高小鼠足趾腫脹的炎性滲出物中PGE2含量(P＜0.01)。其中SME中劑量組與SECG組具有明顯差異(P＜0.01)，說明相同劑量下，SME的效果明顯優(yōu)于SECG(見表1)。

表1 SME對角叉萊膠致小鼠足趾腫脹的影響(±s，n=10)Table.1 Effect of SME on carrageenan-induced paw edema

表1 SME對角叉萊膠致小鼠足趾腫脹的影響(±s，n=10)Table.1 Effect of SME on carrageenan-induced paw edema

與對照組比較，*P＜0.05;與對照組比較，**P＜0.01;與SECG組比較，#P＜0.05;與SECG組比較，##P＜0.01。

組別 給藥量/(mg/kg) 腫脹度/% PGE2吸光度/(A/g) PGE2濃度/(A/g)對照組-23.4±3.6 0.170±0.027 1.112±0.211阿司匹林組 200 9.7±3.7** 0.122±0.017** 0.764±0.106**SECG組 30.90 18.8±4.6* 0.140±0.014** 0.896±0.090**SME組 15.45 25.6±7.5 0.155±0.014 1.110±0.100 30.90 14.7±4.6**# 0.123±0.013**## 0.809±0.086**#61.80 8.8±2.6** 0.115±0.016** 0.708±0.081**

3.2 小鼠凝血時(shí)間試驗(yàn)

結(jié)果表明，SECG組及SME各個劑量組均可以延長小鼠的凝血時(shí)間(P＜0.01)。其中SME中劑量組與SECG組具有明顯差異(P＜0.01)，說明相同給藥劑量下，SME組的效果優(yōu)于SECG組(見表2)。

表2 SME對小鼠凝血時(shí)間的影響(±s，n=10)

表2 SME對小鼠凝血時(shí)間的影響(±s，n=10)

與對照組比較，**P＜0.01;與SECG組比較，##P＜0.01。

組別 給藥量/(mg/kg) 凝血時(shí)間/S對照組-77.1±19.7阿司匹林組 200 152.0±30.7**SECG組 30.90 139.9±28.9**SME組 15.45 143.1±17.1**30.90 196.8±49.5**##61.80 233.0±53.7**

3.3 大鼠動靜脈旁路血栓試驗(yàn)

結(jié)果表明，SECG組及SME高、中劑量組均可以抑制血栓形成(P＜0.05，P＜0.01)。其中SME中劑量組與SECG組具有明顯差異(P＜0.05)，說明相同劑量下，SME組的效果優(yōu)于SECG組(見表3)。

表3 SME對大鼠動靜脈旁路血栓形成的影響(ˉx ±s，n=10)Table.3 Effect of SME on thrombus in arteriovenous shut of rats

3.4 大鼠血瘀證模型試驗(yàn)

結(jié)果表明，SECG組及SME高、中、低等劑量組均可以抑制血小板聚集(P＜0.01)，其中SME中劑量組與SECG組具有明顯差異(P＜0.05)，說明相同劑量下，SME的抑制血小板聚集的影響強(qiáng)于SECG(見表4)。

表4 SME對大鼠血瘀證模型血小板聚集的影響(ˉ ±s，n=10)Table.4 Effect of SME on anti-platelet aggregation in modle of blood stasis of rats

表4 SME對大鼠血瘀證模型血小板聚集的影響(ˉ ±s，n=10)Table.4 Effect of SME on anti-platelet aggregation in modle of blood stasis of rats

與模型組比較，**P＜0.01;與SECG組比較，#P＜0.05。

組別 給藥量/(mg/kg)血小板聚集率/%血小板聚集抑制率/%對照組-32.99±6.19 -模型組 - 65.70±12.14 -阿司匹林組 200 24.10±6.99** 63.29 SECG組 20.50 18.20±8.01** 72.28 SME組 10.25 27.28±8.71** 58.45 20.50 11.20±2.70**# 82.90 41.00 8.76±3.18**86.65

3.5 大鼠心肌缺血再灌注模型試驗(yàn)

3.5.1 SME對大鼠心肌缺血再灌注模型心肌損傷后生化指標(biāo)的影響

結(jié)果表明，SECG組、SME組均能明顯抑制大鼠血清LDH、CK活性、MDA含量的升高并增強(qiáng)心肌組織SOD活性(P＜0.01);與SECG相比，相同給藥量時(shí)SME能更明顯的抑制大鼠血清LDH、CK及心肌組織MDA含量的升高，并增強(qiáng)心肌組織SOD活性(P ＜0.05，P ＜0.01)(見表5)。

表5 SME對大鼠心肌缺血再灌注模型心肌損傷后生化指標(biāo)的影響(±s，n=8)Table.5 Effect of SME on CK，LDH，SOD activity and the content of MDA of rats in ischemia-reperfusion injury

表5 SME對大鼠心肌缺血再灌注模型心肌損傷后生化指標(biāo)的影響(±s，n=8)Table.5 Effect of SME on CK，LDH，SOD activity and the content of MDA of rats in ischemia-reperfusion injury

與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與SECG組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。

組別 給藥量/(mg/kg) CK/(U/mL) LDH/(U/L) SOD/(U/mL) MDA/(nmol/mL)對照組-1.11±0.24 5409±354 148.1±8.6 2.56±0.41模型組 - 3.26±0.24## 7 525±525## 77.8±5.6## 6.21±0.77##SECG組 20.5 2.12±0.18** 6 125±226** 112.4±10.2** 3.73±0.38**SME組 20.5 1.43±0.25**$$ 5 408±296**$$ 122.6±8.2**$ 2.71±0.48**$$

3.5.2 SME對心肌缺血再灌注模型造模后心肌梗死面積的影響

結(jié)果表明，與對照組比較，心肌缺血再灌注造模后，模型組心肌梗死面積急劇升高(P＜0.01)，SECG組、SME組均能明顯減少心肌梗死面積(P＜0.01);相同給藥量時(shí)SME比SECG能更明顯的減少心肌梗死面積(P＜0.05)(見圖1，表6)。

3.5.3 SME對心肌缺血再灌注模型造模后血清TNF-α和心肌缺血再灌注區(qū)域TNF-α mRNA表達(dá)的影響

圖1 SME對心肌缺血再灌注造模后心肌梗死面積的影響(±s，n=8)Fig.1 Effect of SME on the infraction size of rats in ischemia-reperfusion injury

表6 SME對大鼠心肌缺血再灌注模型心肌梗死面積、TNF-α、缺血再灌注區(qū)域TNF-α的mRNA表達(dá)和 NF-кB 蛋白表達(dá)的影響( ±s，n=8)Table.6 Effect of SME on the infraction size，TNF-α，TNF-α mRNA expression and NF-кB proteins expression of rats in ischemia-reperfusion injury

表6 SME對大鼠心肌缺血再灌注模型心肌梗死面積、TNF-α、缺血再灌注區(qū)域TNF-α的mRNA表達(dá)和 NF-кB 蛋白表達(dá)的影響( ±s，n=8)Table.6 Effect of SME on the infraction size，TNF-α，TNF-α mRNA expression and NF-кB proteins expression of rats in ischemia-reperfusion injury

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與SECG組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。

組別 給藥量15模型組 - 51.61±7.24** 6.50±1.40** 0.219±0.041* 0.823±0.078**SECG組 20.5 29.17±4.38## 3.77±0.86## 0.129±0.018## 0.587±0.062#SME組 20.5 21.26±6.14##$$ 2.16±0.50##$$ 0.054±0.039##$ 0.437±0.057蛋白表達(dá)對照組 - 4.75±1.07 3.52±0.91 0.047±0.069 0.283±0.0/(mg/kg) 心肌梗死面積/% 血清TNF-α表達(dá) 缺血再灌注區(qū)域TNF-αmRNA 表達(dá)缺血再灌注區(qū)域NF-кB##$

結(jié)果顯示，與對照組比較，心肌缺血再灌注造模后，模型組大鼠血清中TNF-α含量急劇升高(P＜0.01)，而SECG、SME均能明顯抑制血清TNF-α含量的升高(P＜0.01)，并使心肌缺血再灌注區(qū)域TNF-α mRNA表達(dá)顯著減少(P ＜0.05，P ＜0.01)。與SECG相比，相同給藥量時(shí)SME能更明顯抑制血清TNF-α含量的升高(P＜0.05)，并使心肌缺血再灌注區(qū)域TNF-α mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.05)(見圖2，表6)。

圖2 SME對心肌缺血再灌注區(qū)域TNF-α mRNA表達(dá)的影響(±s，n=8)Fig.2 Effect of SME on TNF-α mRNA expression of of rats in ischemia-reperfusion injury

3.5.4 SME對心肌缺血再灌注造模后心肌缺血再灌注區(qū)域NF-кB蛋白表達(dá)的影響(圖3)

圖3 SME對心肌缺血再灌注造模后心肌缺血再灌注區(qū)域NF-кB蛋白表達(dá)的影響( ± s，n=8)Fig.3 Effect of SME on NF-кB proteins expression of rats in ischemia-reperfusion injury

結(jié)果表明，心肌缺血再灌注造模后，模型組大鼠缺血再灌注心肌區(qū)域NF-кB蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，SECG組和SME組均能顯著降低大鼠心肌缺血再灌注區(qū)域NF-кB蛋白表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01);與SECG相比，相同給藥量時(shí)SME能更明顯的抑制心肌缺血再灌注區(qū)域NF-кB蛋白表達(dá)(P＜0.05)(見圖 3，表6)。

4 討論

中藥制成W/O微乳制劑口服時(shí)，不但能夠增加疏水性藥物的溶解度，如 HSYA［8，9］;還可以因?yàn)閷⑺幬锇谖⑷橹袕亩苊馕改c道中代謝酶的降解，同時(shí)因?yàn)槲⑷榈谋砻鎻埩^低而易于通過胃腸壁的水化層，使藥物能夠直接與胃腸上皮細(xì)胞接觸，從而促進(jìn)藥物的吸收。此外，微乳制劑也可經(jīng)淋巴管吸收，克服了肝臟的首過效應(yīng)，從而提高了藥物的生物利用度［10］。Lyons等將易受胃腸道酶降解的N-乙?；咸烟?N-乙?；邗６?GMDP)制成含中等鏈長脂肪酸的W/O微乳劑，其生物利用度從水溶液的(8.3±4.4)%提高到微乳劑型的(80.1 ±30.4)%［11］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，舒胸片微乳劑型與有效成分組均能夠使前列環(huán)素PGE2升高，抑制足趾腫脹、抑制血栓形成、延長凝血時(shí)間和抵抗由ADP引起的血小板聚集，改善血液微循環(huán)，并且統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示微乳化劑型優(yōu)于有效成分組，微乳化劑型的藥效與劑量呈依賴性，高中低劑量具有明顯的量效關(guān)系。同時(shí)微乳化劑型和有效成分組均能使心肌缺血再灌注過程中的各種內(nèi)源性抗氧化酶如SOD升高;使得脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成減少;使肌酸激酶CK、乳酸脫氫酶LDH的活性降低，減少心肌梗死后的染色面積;使炎癥調(diào)節(jié)因子TNF-α血清中水平降低，心肌再灌注區(qū)域TNF-α的mRNA表達(dá)減少;使再灌注區(qū)域的核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的蛋白表達(dá)抑制。研究結(jié)果提示SME與SECG保護(hù)缺血再灌注心肌的作用機(jī)理，與抑制NF-кB信號通路活化，阻斷TNF-α的基因表達(dá)，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷有關(guān)［12-13］。結(jié)果分析說明，微乳化劑型的藥效學(xué)作用比有效成分組更加明顯，并且在設(shè)置了高、中、低劑量的實(shí)驗(yàn)中具有良好量效關(guān)系，這可能和微乳化劑型能夠增加其有效成分的體內(nèi)吸收，增加其生物利用度有關(guān)。

我們前期研究先將SXT制成SECG，兩者在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗凝血、抗血栓和心肌保護(hù)試驗(yàn)中作用結(jié)果相同，量效關(guān)系相近，作用結(jié)果一致，研究結(jié)果顯示SECG可代替原處方SXT;此次研究再將SECG制成SME進(jìn)行研究，得到結(jié)論說明微乳化劑型藥效學(xué)作用更佳，說明在中藥制劑中引進(jìn)微乳技術(shù)，可利用其優(yōu)勢解決某些問題，這可能是一個新的方向，但是還需要進(jìn)一步的研究證明。

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