丁志凌，陳 躍，黃占文，張 偉，孫媛媛，張 莉

瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院 核醫(yī)學科，四川 瀘州 646000

磁共振影像(magnetic resonance imaging，MRI)是目前重要的影像學檢查手段，與CT相比具有顯著優(yōu)勢，首先是對軟組織的空間高分辨率可以清晰顯示臟器及周圍組織的對比關系，可以提供精確的臟器解剖信息，其次MRI應用不同的掃描序列和借助增強對比劑可以完成臟器的部分功能檢查。Gd-DTPA是MRI中應用最早、最廣泛的釓類順磁增強對比劑。稀土元素釓(Gd)主要通過質(zhì)子弛豫增強作用縮短周圍組織及液體的T1、T2馳豫時間，主要是T1加權成像，廣泛應用于腫瘤、神經(jīng)、心血管等疾患的診斷。早期應用放射性同位素153Gd研究153Gd-DTPA的生物分布，認為Gd-DTPA屬于細胞外顯像劑，由于分子量小、非脂溶性等因素不能滲透入細胞，靜脈注射后迅速從血管內(nèi)彌散到血管外，分布于細胞外結(jié)締組織間隙中，幾乎完全從腎小球濾過而排出體外。本工作擬通過放射性核素99Tcm標記Gd-DTPA，觀察標記的可能性，并進一步研究99Tcm-DTPA-Gd的生物學分布。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

二乙三胺五乙酸(DTPA)和Gd-DTPA·2H2O均為美國Sigma Aldrich公司產(chǎn)品；氯化亞錫(SnCl2·2H2O)，成都科龍化工試劑廠；三氯乙酸(TCA)，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心。所有試劑均為分析純。成年健康昆明小鼠60只，體重20～30 g；成年家兔3只，體重1.5～2.0 kg，所有實驗動物雌雄不限，均由瀘州醫(yī)學院動物實驗中心提供。

Millennium VG5 SPECT儀，美國GE公司；SN-695型自動γ免疫計數(shù)儀，中國科學院上海物理研究所日環(huán)光電儀器有限公司；MS-1000 自動薄層掃描儀，美國Bioscan公司；99Mo-99Tcm發(fā)生器，北京原子高科股份有限公司。

1.2 99Tcm-DTPA-Gd的制備

1.2.1標記方法 參考文獻[1]中99Tcm-DTPA的標記條件：設定Gd-DTPA與SnCl2摩爾比為10∶1，稱取Gd-DTPA 0.05 mmol(約27 mg)置于淋洗瓶中，用0.4 mL蒸餾水溶解，加入SnCl20.005 mmol(約1.0 mg，用0.1 mol/L HCl溶解)。加入1.0 mL新鮮淋洗的Na99TcmO4溶液(約74～185 MBq)，充分混勻后置45 ℃水浴中反應30 min。本實驗以99Tcm-DTPA作為實驗對照。

1.3 血漿蛋白結(jié)合率測定

家兔心臟采血15 mL，肝素500 IU抗凝，3 000 r/min離心5 min，收集血漿約6 mL。取6支一次性塑料試管，每管加入0.8 mL血漿，分設2組，即99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA組。分別加入0.1 mL(約37 kBq)標記物(99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA分別用生理鹽水稀釋至370 kBq/mL)。含標記物的血漿試管置37 ℃水浴箱孵育2 h后，加入25%三氯乙酸4 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清液；再次加入10%三氯乙酸4 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復2次；每管加入生理鹽水0.4 mL再次離心清洗2次。本實驗設總管(0.1 mL稀釋的標記藥物)、非特異性管(不加血漿，加入0.1 mL稀釋的標記藥物，相同步驟操作)和本底管(未加標記物的試管)。最后用γ計數(shù)器測定試管的放射性計數(shù)，按以下公式計算血漿蛋白結(jié)合率：

血漿蛋白結(jié)合率=(沉淀中的放射性計數(shù)-非特異性管放射性計數(shù))/(0.1 mL標記藥物放射性總計數(shù)-非特異性管放射性計數(shù))×100%。

1.4 小鼠體內(nèi)分布試驗

60只昆明成年小鼠，雌雄不限，隨機分為2組，即99Tcm-DTPA-Gd組和99Tcm-DTPA組。按注射后不同時間點分為6組，每組5只。99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA分別用生理鹽水稀釋至約185 kBq/mL。取0.1 mL(18.5 kBq)標記藥物小鼠尾靜脈注射，分別于注射藥物后1、5、10、15、30、60 min，先摘取眼球眶靜脈取血約1 mL，然后斷頸處死，解剖取出腦、心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉等臟器，其中腎臟和腦組織為完整臟器，其余均剪取部分臟器，置預先稱重及標記的一次性試管中稱重，獲得絕對質(zhì)量(g)。γ計數(shù)器分別測量0.1 mL注射總計數(shù)(Total,T,n=5)、本底管計數(shù)(Background,B,n=5)和每管放射性計數(shù)，計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)，結(jié)果以(均值±標準差)表示。

1.5 家兔顯像

兩只成年家兔用于顯像。SPECT儀配通用平行孔準直器，選擇腎動態(tài)顯像模式，雙時相采集(灌注相，幀/2 s，60 s；功能相，幀/30 s，60 min)。用0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA的pH值為4.0～6.0。0.1 mL (約18.5～37 MBq)標記藥物經(jīng)家兔耳緣靜脈注射，即刻采集，沿雙腎邊緣勾畫感興趣區(qū)(ROI)，計算機處理獲得部分功能參數(shù)，包括分腎攝取百分比(%)、達高峰時間(Tmax)、半排時間(T1/2)。每只家兔均進行99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA顯像對比分析。為了避免前一種藥物的干擾，間隔48 h后進行第二種藥物顯像。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果和討論

2.1 標記物的標記率、放化純度和穩(wěn)定性分析

99Tcm-DTPA-Gd標記溶液外觀澄清透明。以生理鹽水和丙酮為展開劑時，99Tcm-DTPA-Gd與99Tcm-DTPA具有相同的Rf值，即在生理鹽水中Rf=0.9～1.0，在丙酮中Rf=0～0.1。計算99Tcm-DTPA-Gd的標記率為98.7%。室溫放置6 h內(nèi)，標記物放化純均大于95%，可滿足實驗要求。

測得最終標記溶液的pH≈2.0；2種標記物用生理鹽水稀釋至370 kBq/mL時，測pH值均為6.0～6.2；0.8 mL血漿中加入0.1 mL稀釋后的標記物(370 kBq/mL)，測pH值均為7.2左右。兩種標記物分別用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 為4.0～6.0，測定放化純無明顯變化，均大于95%。

2.2 血漿蛋白結(jié)合率

99Tcm-DTPA是核醫(yī)學檢查中常用的腎動態(tài)顯像劑，靜脈注射后幾乎全部經(jīng)腎小球濾過，是目前公認的評價腎小球濾過率的最佳方法[2]。一般認為99Tcm-DTPA體內(nèi)的血漿蛋白結(jié)合率在3%～10%，這種差異與藥盒組成有關。本實驗用三氯乙酸沉淀法測定99Tcm-DTPA-Gd在家兔血漿中的蛋白結(jié)合率。實驗中測得總管放射性計數(shù)約為40 000；沉淀放射性計數(shù)約為1 600；非特異性管約為180；本底管約為160(均為均數(shù))。測得99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA的血漿蛋白結(jié)合率分別為(3.80±0.25)%和(3.48±0.26)%。配對t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.104)。

Gd-DTPA類順磁增強對比劑廣泛應用于腫瘤、神經(jīng)、心血管以及腎臟的形態(tài)和功能檢查[3]。Gd-DTPA靜脈注入機體后，主要分布在細胞外液經(jīng)腎臟排泄，1～3 h約80%排除體外，體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合率很低。DTPA是重要的8齒配體，其分子結(jié)構(gòu)中含有3個氮原子和5個羧基，螯合能力強，進入體內(nèi)幾乎全部經(jīng)腎小球濾過而排除體外。Gd與DTPA絡合穩(wěn)定，在體內(nèi)外穩(wěn)定性好而不易解離，DTPA的部分配位原子與Gd(Ⅲ)絡合，分子中存在過剩的配位原子，99Tcm在適當?shù)臈l件下可以與Gd-DTPA形成螯合物。

2.3 標記物在小鼠體內(nèi)生物分布

表1列出了99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA在健康昆明小鼠血液及主要臟器的每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。 由表1可知，2種標記物具有相似的生物分布，注射后1 min血液攝取均達到最高，分別為(14.79±9.77)%ID/g和(10.65±4.28)%ID/g；99Tcm-DTPA-Gd 在注射后1 min腎臟攝取達最高((26.02±8.50)%ID/g)，注射后5 min腎臟排泄大于50%。99Tcm-DTPA在注射后5 min腎臟攝取最高((16.86±5.55)%ID/g)，注射后5～10 min腎臟排泄約至50%。各時間點，腦組織分布最少(小于1%ID/g)；心臟、肝臟、脾臟和肺臟有部分攝取。注射后60 min兩種標記物在各主要臟器內(nèi)分布很少，其中99Tcm-DTPA-Gd組各臟器攝取率均小于1%ID/g，99Tcm-DTPA在血液、肺臟和腎臟攝取率大于1%ID/g。

表1 99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA在小鼠體內(nèi)的生物分布Table 1 Biodistribution of 99Tcm-DTPA-Gd and 99Tcm-DTPA in mice

注(Note)：n=5

Gd-DTPA與99Tcm-DTPA具有相同的腎臟濾過和排泄機制，Gd-DTPA通過靜脈進入機體后，存在于細胞外的組織液，不進入細胞內(nèi)，幾乎全部經(jīng)腎臟由腎小球濾過排泄，24 h排泄率大于90%。Weinmann等[4]用153Gd標記DTPA，以大鼠為實驗對象，結(jié)果表明，靜脈注射153Gd-DTPA 后5 min約10%分布于全身血液；血液濃度清除半衰期約20 min；至3 h約80%通過腎臟排泄出體外，腎臟排泄半衰期約20 min；7 d后，有90%回收于尿液，7%來自糞便。Prato等[5]研究表明，盡管153Gd-DTPA與99Tcm-DTPA分布特性比較接近，排泄相似，但99Tcm-DTPA在血液和肺臟的滯留超過153Gd-DTPA，而腎臟的滯留低于153Gd-DTPA，原因是99Tcm-DTPA的部分血漿蛋白結(jié)合。李明等[6]的研究顯示153Gd-DTPA與99Tcm-DTPA排泄基本相同，153Gd-DTPA血液清除符合2室模型，T1/2(α)為1.5 min，T1/2(β)為29.9 min。本實驗中99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA的血漿蛋白結(jié)合率沒有顯著性差異，兩種標記藥物在小鼠體內(nèi)具有相似的生物分布，99Tcm-DTPA-Gd主要經(jīng)腎臟排泄，由于血腦屏障的完整性，99Tcm-DTPA-Gd不能進入正常腦組織，注射后60 min，大部分排出體外而沒有臟器的特異性滯留。

2.4 家兔腎動態(tài)顯像

正常成年家兔腎動態(tài)顯像顯示注射99Tcm-DTPA-Gd 后1 min雙腎影逐漸出現(xiàn)，至5 min時清晰顯影。正常家兔注射兩種標記藥物后6.5～8.0 min的腎動態(tài)顯像圖像分別示于圖1、2。由圖1、2可知，標記藥物主要濃聚于雙腎和膀胱，至顯像結(jié)束，大部分標記藥物聚集在膀胱，雙腎有少量滯留，血周圍本底較低，無其它臟器的特異性攝取和滯留。正常家兔注射兩種標記藥物后腎動態(tài)顯像的功能參數(shù)列入表2。由表2可知，99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA的排泄基本相同，腎臟達高峰時間約為5～10 min，半排時間約為10～20 min。

綜上，99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA在生物體內(nèi)的排泄和分布基本相同，可能與二者具有相同的血漿蛋白有關。藥物的血漿蛋白結(jié)合是影響藥物排泄和分布的一個重要因素。Russell等[7]研究了3種來自不同廠家的腎動態(tài)顯像劑藥盒(99Tcm-DTPA)，結(jié)果顯示各藥盒標記物的血漿蛋白結(jié)合存在顯著性差異，這種差異影響到了腎小球濾過率(GFR)的正確計算。同時，實驗結(jié)果顯示，兩種標記藥物在動物體內(nèi)的分布和排泄又不完全相同，其中影響因素較多，包括標記藥物的標記率、放化純度、注射方法、注射劑量、藥物的分子量、電荷性以及組織器官的病理生理特性等等。其中Assadi等[8]研究認為不同劑量的99Tcm-DTPA測定GFR會有不同的結(jié)果。普遍認為99Tcm-DTPA進入體內(nèi)后僅存在于細胞外組織間隙而不彌散進入細胞內(nèi)，除腎臟攝取排泄外不會被其它臟器特異性攝取。但Arheden等[9]在一項大鼠的試驗研究中卻發(fā)現(xiàn)99Tcm-DTPA在缺血后再灌注的受損心肌中有較高的滯留，源于受損的心肌不能有效清除99Tcm-DTPA所致。

圖1 正常家兔注射99Tcm-DTPA-Gd后腎動態(tài)顯像Fig.1 Renal scintigram with 99Tcm-DTPA-Gd in rabbit after injection(a)——6.5 min，(b)——7.0 min，(c)——7.5 min，(d)——8.0 min

圖2 正常家兔注射99Tcm-DTPA后腎動態(tài)顯像Fig.2 Renal scintigram with 99Tcm-DTPA in rabbit after injection (a)——6.5 min，(b)——7.0 min，(c)——7.5 min，(d)——8.0 min

標記物(Labelingcompounds)家兔(Rabbits)放射性攝取(Uptakeratio)/%Tmax/minT1/2/min左腎(Leftkidney)右腎(Rightkidney)左腎(Leftkidney)右腎(Rightkidney)左腎(Leftkidney)右腎(Rightkidney)99Tcm?DTPA142957178681020125054953131607599Tcm?DTPA?Gd13826186888141165250549553438295

醫(yī)學影像技術的發(fā)展逐漸向多模式的圖像融合發(fā)展，其中多模式顯像劑的研究是目前的一個熱點[10]。筆者認為，在本實驗的基礎上可以進一步研究設計一種新型的顯像劑，適用于SPECT和MRI顯像，通過影像融合技術以提高腫瘤診斷的準確性。

3 結(jié) 論

應用放射性核素99Tcm標記磁共振增強對比劑Gd-DTPA方法簡單、標記率高、穩(wěn)定性好。Gd-DTPA與99Tcm連接后，動物體內(nèi)外實驗顯示標記后Gd-DTPA生物分布特性基本沒有改變。99Tcm-DTPA-Gd與99Tcm-DTPA具有相似的生物分布，應用99Tcm標記順磁對比劑Gd-DTPA既可進行動物體內(nèi)藥代動力學的研究，也可通過活體動物核素顯像直接觀察Gd-DTPA的代謝和排泄。本實驗顯示DTPA作為一個雙功能螯合劑可以同時鏈接99Tcm和Gd，對于一些新型具有臟器特異性的Gd-DTPA類順磁顯像劑，或許可以通過這種標記方法進行藥代動力學的研究。

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