李東娟 萬云云

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 泰安 271000； 2. 泰安衛(wèi)生學(xué)校，山東 泰安 271000)

在動脈粥樣硬化(athrosclerosis,AS)發(fā)生的早期，最主要的變化是動脈內(nèi)皮功能的紊亂，血管內(nèi)皮細胞的損傷及功能改變是AS發(fā)生的初始環(huán)節(jié)[1]。氧化應(yīng)激通過產(chǎn)生氧自由基介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷，與動脈粥樣硬化發(fā)生等病理過程密切相關(guān)[2]。因此，尋找新的抗自由基和保護血管內(nèi)皮細胞的藥物對于防治動脈粥樣硬化相關(guān)疾病有著重要意義。槲皮素及其衍生物是植物界分布最廣的黃酮類化合物，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮，其藥理活性主要有抗氧化、抗炎、降血壓、抗血小板聚集、抗癌變、抗衰老、抗突變、抗動脈粥樣硬化等作用。研究證明，槲皮素的抗衰老、抗突變、抗動脈粥樣硬化等生物活性都與抗氧化作用有關(guān)。隨著人類對槲皮素作用的深入了解,其抗氧化活性已引起廣泛關(guān)注[3]。本研究通過建立H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷模型，將Que作用于H2O2誘導(dǎo)的HUVECs，觀察其對H2O2誘導(dǎo)HUVECs的影響，探討Que對血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用，為其在心血管疾病防治中的作用提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1藥物與試劑 槲皮素為Sigma產(chǎn)品，I型膠原酶、胰酶和DMEM+F12培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司； MTT購自美國Sigma公司； PAA Gold A11-649胎牛血清購自PAA laboratories, Austria；D-Hank’s液實驗室配制。缺口末端標(biāo)記試劑盒(TUNEL)、MDA、SOD、LDH試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2主要儀器 SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；SANYO MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱(SANYO Electric, Japan)；倒置相差顯微鏡(Olympus)；酶聯(lián)免疫檢測儀(英國Labsys- tems公司)。

2 方法

2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 取出生1h內(nèi)新生兒臍帶用0.1%膠原酶灌注消化臍靜脈內(nèi)皮，以20%胎牛血清的DMEM+F12培養(yǎng)，融合生長至80%-90%即行傳代。倒置顯微鏡下，細胞呈典型的鋪路石狀鑲嵌排列。第Ⅷ因子相關(guān)抗原間接免疫熒光法鑒定呈陽性。第2-3代細胞用于實驗。

2.2形態(tài)學(xué)觀察 調(diào)整細胞密度為1×106/L接種于96及24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h同步化后，隨機分三組：陰性對照組(加等量D-Hank’S液)、模型組(200umol/L)、Que組(62.5、125、250 umol /L)，各組設(shè)8個復(fù)孔，于光鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.3MTT法測定細胞存活率 在上述條件下培養(yǎng)24 h，然后用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，加入Que，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將200umol/L H2O2加入模型組和Que組，刺激細胞6 h，每孔加入20ulMTT，37℃孵育4 h，傾去上清液，每孔加二甲基亞砜150ul，振蕩數(shù)分鐘，使紫色結(jié)晶甲臜充分溶解，在全自動酶標(biāo)儀上于570 nm處測定吸光值(OD值)。

2.4Que對H2O2損傷血管內(nèi)皮細胞MDA和LDH水平的影響 測定釋放到培養(yǎng)基中MDA和LDH的量來判斷細胞損傷狀況。收集培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞并調(diào)節(jié)細胞密度為1×106/L，接種于24孔板,待細胞達70% ～80%后，分組同上。各實驗組作用后收集培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書操作，比色法測定培養(yǎng)上清液和細胞裂解液中MDA和LDH的水平。

2.5超氧化物歧化酶活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法：黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紅色，分光光度計測其吸光度，計算被測樣品中的SOD活性。

2.6TUNEL檢測細胞凋亡 按TUNEL試劑盒說明操作，計算陽性細胞凋亡率(%)。

3 結(jié) 果

3.1細胞形態(tài)觀察：倒置顯微鏡下動態(tài)觀察可見陰性對照組細胞緊密貼壁，呈鋪路石狀生長。模型組可見多數(shù)細胞呈圓形，胞膜空泡，核濃縮；Que組見上述細胞較模型組明顯減少。

3.2Que對H2O2損傷內(nèi)皮細胞活性的影響 H2O2可引起HUVECs活性降低，與對照組比較差異有顯著性(P<0. 01)，而Que各濃度組可抑制H2O2損傷引起的活性降低(P<0. 01)，且有隨濃度增加而細胞活性增強的趨勢(表1)。

表1 Que對H2O2誘導(dǎo)HUVECs活性的影響

注：與對照組比較:*P<0.01 與模型組比較:▲P<0.01

3.3Que對H2O2損傷血管內(nèi)皮細胞MDA、SOD和LDH水平的影響：H2O2損傷可引起細胞內(nèi)MDA和LDH釋放增加，而SOD活性明顯降低；Que預(yù)作用于損傷的細胞后，與模型組比較，MDA和LDH釋放隨濃度增加減少，SOD活性有所升高(P<0. 05，表2)。

表2 Que對H2O2損傷HUVECs釋放MDA、SOD和LDH的影響

注：與對照組比較:*P<0.01 與模型組比較:▲▲P<0.05，▲P<0.01

3.4Que對HUVECs凋亡的影響 與陰性對照組對比, H2O2明顯誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生(P<0.01)。不同濃度Que組能明顯減少細胞凋亡的發(fā)生, 與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)，以250umol/L濃度作用最強(P<0.01)，但與陰性對照組相比均未能達到正常水平(P<0.05，表3,圖1)。

表3 Que對H2O2誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響

注：與對照組比較:**P<0.05,*P<0.01 與模型組比較:▲▲P<0.05▲P<0.01

陰性對照組(×200)

模型組(×200)

ue62.5 umol /L組(×200)

Que125umol/L組(×200)

Que250umol/L組(×200)

4 討 論

以AS為基礎(chǔ)的心腦血管疾病是目前系統(tǒng)發(fā)病率和病死率最高的疾病。血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷與AS的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系，它是AS的始動因素[4]。H2O2是機體產(chǎn)生的活性氧，在過氧化條件下能分解成一系列復(fù)雜產(chǎn)物，如氧自由基。氧自由基可與生物膜中的主要成份多價不飽和脂肪酸作用，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物及醛類產(chǎn)物，進一步損害生物膜，膜通透性增加，導(dǎo)致組織損傷，最終形成動脈粥樣硬化斑塊[5]。也有研究證明氧自由基的急性和慢性超載存在于動脈粥樣硬化的全過程，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷和加快內(nèi)皮細胞凋亡[6-7]。H2O2在一定濃度范圍內(nèi)促使內(nèi)皮細胞損傷和內(nèi)皮細胞凋亡，過高濃度則導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)不可逆的損傷而致細胞死亡[8]。

噻唑鹽(MTT)能被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中，該物質(zhì)被二甲基亞砜溶解后，在570 nm處有一最大吸收峰，以酶標(biāo)儀可定量測定其含量。通過MTT實驗可直接反映細胞的活力，進而間接地反映細胞的存活情況[9-10]。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)成正比。本實驗通過MTT法證實，H2O2可明顯降低HUVECs活性, 不同濃度喬松素能顯著增強HUVECs的活性，說明Que具有抗H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的損傷的作用。

LDH是細胞損傷后的代謝產(chǎn)物，它的活力反映細胞損傷的程度。MDA不僅是細胞損傷的代謝產(chǎn)物，而且是導(dǎo)致細胞損傷的機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的LDH和MDA增多，這表明H2O2能引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化損傷，同時也抑制了細胞的增殖代償能力。Que的預(yù)作用可抑制H2O2的損傷作用，使LDH活力和MDA含量降低。機體正常下存在完整的抗氧化體系，如SOD過氧化物酶在細胞漿和線粒體內(nèi)發(fā)揮重要的防御作用。H2O2導(dǎo)致的抗氧化酶活力下降，清除氧自由基的能力降低等會進一步加重細胞損傷。本研究表明Que可提高損傷內(nèi)皮細胞中SOD的活力。由此可見，Que可以減輕H2O2引起的內(nèi)皮細胞的損傷，對血管內(nèi)皮細胞損傷時的保護具有重要意義。

在正常情況下，內(nèi)皮細胞的增殖率和凋亡率都很低，內(nèi)皮細胞凋亡與增殖之間的動態(tài)平衡維持內(nèi)皮細胞數(shù)量的穩(wěn)定和血管功能的正常}。多項研究證實內(nèi)皮細胞損傷、功能異常是冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件，而內(nèi)皮細胞的過度凋亡卻是內(nèi)皮細胞功能失調(diào)的始動環(huán)節(jié)[12]。并且在動脈粥樣硬化斑塊形成的過程中，存在血管內(nèi)皮細胞凋亡現(xiàn)象，并反過來參與和加速動脈粥樣硬化進程。本實驗通過TUNEL法明顯觀察到，三種濃度的Que均能部分拮抗H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，說明Que可抑制H2O2對HUVECs的損傷，減少內(nèi)皮細胞的凋亡，發(fā)揮其保護血管內(nèi)皮細胞的功能，其確切機制有待進一步實驗證明。

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