張興旺,陶燕鐸,梅麗娟,邵 赟

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海西寧 810008;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049)

龍膽花為藏醫(yī)常用品種,分為白花龍膽和雜花龍膽,在臨床上為多品種入藥,具有清濕熱、瀉肝膽實(shí)火、鎮(zhèn)咳、利喉、健胃功能,主治感冒發(fā)燒、目赤咽痛、肺熱咳嗽、胃熱、腦痧、尿道熱、陰癢及陰部濕疹、天花等[1]?！端{(lán)琉璃》云:“邦見(jiàn)按花色不同可分為白色、藍(lán)色和雜色三類(lèi)。”。龍膽花常作為藏成藥的君藥或臣藥,如龍膽花丸、十五味龍膽丸、三味龍膽丸等。龍膽科植物主要含有的裂環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化學(xué)成分龍膽苦苷、獐牙菜苷等,是龍膽科的苦味成分和活性成分[2]。本實(shí)驗(yàn)首次建立了藏藥 7種龍膽花中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量測(cè)定的 HPLC方法,并對(duì)它們的含量進(jìn)行了比較,為龍膽花多品種入藥提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與材料

微波實(shí)驗(yàn)儀 (帶回流、磁力攪拌);Agilent 1200LC高效液相色譜儀,G1379A在線(xiàn)脫氣機(jī),G1311A四元泵,G1329A標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A柱溫箱,Agilent1200色譜工作站,AG204電子分析天平

麻花秦艽 (Gentiana straminea Maxim.)花、達(dá)烏里秦艽 (Gentiana dahuricaFisch.)花、黃管秦艽(Gentiana officinalisH.Smith)花、管花秦艽 (Gentiana siphonanthaMaxim.Ex Kusnez.)花、線(xiàn)性龍膽(Gentiana lawrenceiBurk.)、云霧龍膽 (Gentiana nubigenaEdgew.)花,藍(lán)玉簪龍膽 (Gentiana veitchiorum Hemsl.)花于 2009年 8月采自青海省境內(nèi),均為野生,海拔均在 3 500 m以上,由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所梅麗娟高級(jí)工程師鑒定。

甲醇、磷酸均為分析純,色譜用甲醇為色譜純。龍膽苦苷 (批號(hào)為:110770-200308)、購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,純度大于 98%;獐牙菜苦苷由作者從麻花秦艽中分離得到,經(jīng)歸一化法檢測(cè),純度大于 98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Fusion-RP 80 Ac18柱 (150 mm×4.6 mm,5μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:甲醇 -0.2%磷酸溶液梯度洗脫 (0～25 min:15%～30%);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 240 nm;進(jìn)樣量:5μL。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品 (a)和樣品 (b)HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取獐牙菜苦苷,龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品適量,加甲醇制成 0.105 g·L-1,0.3 g·L-1的溶液 ,搖勻 ,0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取龍膽花樣品約 0.5 g,精密稱(chēng)定,置 250 mL平底燒瓶中,加入 20 mL甲醇,置微波實(shí)驗(yàn)儀中,回流攪拌提取 20 min,冷卻至室溫,濾過(guò),濾液收集到50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,0.45μm微孔濾膜濾過(guò),即得供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍

分別精密吸取對(duì)照品溶液 1,3,5,7,9μL,在上述色譜條件依次進(jìn)樣,以進(jìn)樣量 (X)為橫坐標(biāo),峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),回歸方程見(jiàn)表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精確吸取對(duì)照品溶液 10μL,按 2.1節(jié)色譜條件測(cè)定 5次,結(jié)果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的RSD分別為 1.21%,0.84%,表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取麻花秦艽花約 0.5 g,精密稱(chēng)定,按 2.3節(jié)方法制備供試品溶液,分別在 0,2,4,6,8,12 h后在上述色譜條件下進(jìn)樣 5μL,結(jié)果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的 RSD分別為 1.1%,1.54%,表明樣品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取麻花秦艽花約 0.5 g,精密稱(chēng)定,按上述供試品溶液的制備方法和測(cè)定條件,重復(fù)測(cè)定 5份,結(jié)果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的 RSD分別為 1.3%,1.62%,表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知獐牙菜苦苷,龍膽苦苷含量的麻花秦艽花樣品 5份,每份約 0.5 g,精密稱(chēng)定,加入對(duì)照品獐牙菜苦苷 1.002 mg,龍膽苦苷 4.012 mg,制備樣品溶液。精密吸取 5μL進(jìn)樣分析,計(jì)算平均回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 獐牙菜苦苷,龍膽苦苷加樣回收率

2.9 樣品含量測(cè)定

取供試品溶液,過(guò) 0.45μm的微孔濾膜,分別進(jìn)樣 5μL,測(cè)定 (n=5),取 5次測(cè)定的平均值,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 7種龍膽花中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 7種龍膽花中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷含量的比較

由表3可以看出,黃管秦艽花中獐牙菜苦苷的含量最高為 0.712%,云霧龍膽花含量最低為0.222%,其他龍膽花介于二者之間。管花秦艽中龍膽苦苷的含量最高為 3.21%,黃管秦艽中的含量最低為 1.60%,本實(shí)驗(yàn)對(duì)這 7種龍膽花中 2種主要有效成分的含量進(jìn)行了比較,可為龍膽花多品種入藥提供科學(xué)的依據(jù)。

3.2 不同提取方法的比較

比較了 3種提取法:甲醇加熱回流 30 min;甲醇微波回流 (帶磁力攪拌)20 min和甲醇超聲 30 min。結(jié)果表明:7種藥材微波提取率均大于加熱回流法和超聲法,而且與其他提取方法相比,微波輔助提取法具有提取時(shí)間短、溶劑消耗及廢物產(chǎn)生量低、提取選擇性和提取物的純度高等特點(diǎn)而被廣泛用于天然植物的提取中[3-7]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還比較了提取10 min、20 min、30 min對(duì)藥材提取率的影響 ,結(jié)果表明 20 min與 30 min提取率接近,因此,采用微波動(dòng)態(tài)回流提取法提取 20 min對(duì) 7種龍膽花進(jìn)行提取制樣。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

將獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對(duì)照品溶液在 200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果在 240 nm處有較好吸收,故選擇 240 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 流動(dòng)相的選擇

在篩選獐牙菜苦苷與龍膽苦苷兩種活性成分測(cè)定的色譜條件過(guò)程中,曾嘗試過(guò)用不同比例的甲醇-0.2%的磷酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,發(fā)現(xiàn)甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫 (0～25 min:15%～30%),流速:1 mL/min,7種龍膽花中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷的色譜峰與共存組分完全達(dá)到基線(xiàn)分離。

[1] 劉 圓,孟慶艷,彭鐮心,等.RP-HPLC法測(cè)定藏藥龍膽花的兩種原植物白花龍膽和藍(lán)玉簪龍膽中龍膽苦苷[J].中草藥,2006,37(11):1783.

[2] 北京醫(yī)學(xué)院,北京中醫(yī)學(xué)院.中草藥成分化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1884:344.

[3] GARCIA-AYUSO L E,VELASCO J,DOBARGANES M C,et al.Determination of the oil content of seeds by focused microwave-assisted soxhlet extraction[J].Chromatographia,2000,52(1/2):103-108.

[4] EIGUREN FERN AND EZA,SOSA FERRERA Z,SANTANA RODR1GUEZ J J.Microwave-assisted extraction of organochlorine compounds in marine sediments with organized molecular systems[J].Chromatographia,2001,53(7/8):375-379.

[5] PAN Xuejun,NIU Guoguang,LIU Huizhou.Microwave-assisted extraction of tanshinones from salvia miltiorrhiza bunge with analysis by high2perfor mance liquid chromatography[J].J Chromatogr:A,2001,922:371-375.

[6] 萬(wàn)益群,吳世芳.何首烏中磷脂類(lèi)化合物的微波輔助萃取/高效液相色譜法測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2008,27(7):782-784.

[7] 周 圍,李雪梅.中藥材中擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的微波萃取/氣相色譜檢測(cè)[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2007,26(6):884-887.