王昆華， 張 杰， 龔昆梅， 肖 樂(lè)， 歐陽(yáng)一鳴， 劉為軍， 凌 平， 黃映光， 龍亞新， 郭世奎

CD1是一類無(wú)多態(tài)性的蛋白質(zhì)家族，人CD1的5個(gè)等位基因編碼4種蛋白產(chǎn)物——CD1A、CD1B、CD1C、CD1D。其中CD1D是唯一存在于人和鼠中的一類蛋白分子，由CD1介導(dǎo)的抗原加工呈遞也要經(jīng)過(guò)一系列的加工修飾過(guò)程，但不同于MHC-Ⅰ 類分子和MHC-Ⅱ 類分子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。現(xiàn)已證實(shí)CD1分子與多種免疫性疾病及腫瘤性疾病有關(guān)。此外，有研究顯示：腫瘤細(xì)胞能通過(guò)改變自身細(xì)胞表面糖脂結(jié)構(gòu)或改變其膜性糖脂，逃避CD1D的NK/T細(xì)胞殺傷效應(yīng)，提示通過(guò)CD1D介導(dǎo)的NK/T細(xì)胞激活能實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫的基因治療[1]。近年來(lái)的研究認(rèn)為，多數(shù)腫瘤細(xì)胞存在腫瘤特異性抗原和/或腫瘤相關(guān)抗原，但仍能逃避免疫監(jiān)視，其重要原因之一是腫瘤細(xì)胞缺乏B7-1等輔助刺激分子，不能為T細(xì)胞活化提供所必須的第二信號(hào)。若能將B7-1基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞表達(dá)B7-1分子，使其與MHC分子聯(lián)合以完善抗腫瘤免疫的雙信號(hào)系統(tǒng)，共同刺激、誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生，則可能逆轉(zhuǎn)這種免疫無(wú)能狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞的免疫原性，激發(fā)機(jī)體T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫，誘導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)，從而達(dá)到治療惡性腫瘤的目的。我們?cè)噲D構(gòu)建表達(dá)小鼠CD1D基因和 B7-1基因的真核表達(dá)載體，為今后有效利用基因免疫療法、治療腫瘤疾病提供基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5α、真核質(zhì)粒pcDNA3由昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供，限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、凝膠純化試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，B7-1引物、CD1D引物由大連寶生物公司合成，Trizol購(gòu)自Progema公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠總RNA提取 (1) 處死C57BL/6小鼠，取100 mg新鮮脾臟組織放入DEPC處理過(guò)的勻漿器中，加1 mL預(yù)冷的Trizol，冰浴中勻漿至無(wú)組織塊。(2) 將勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入200 μL氯仿，用力振蕩EP管直到充分混勻，4℃ 12 000 g離心10 min。(3) 上層水相移至另1支EP管中，加入250 μL異丙醇沉淀RNA，室溫放置5～10 min。(4) EP管4℃ 12 000 g離心10 min，去上清液。(5) 加入1 mL 75%乙醇，4℃ 7 500 g離心5 min，去上清。EP管倒置干燥，加入DEPC處理過(guò)的雙蒸水20 μL，溶解RNA保存于-80℃冰箱。

1.2.2 紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度 取1 μL RNA溶于雙蒸水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA的OD260，OD260/OD280以測(cè)定濃度和純度。

1.2.3 RT反應(yīng) 反應(yīng)體系10 μL，包括：RT Buffer、dNTP、RNaes inhibitor、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo dT-adaptor、總RNA，37℃反應(yīng)1 h，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，用反應(yīng)產(chǎn)物做PCR反應(yīng)。

1.2.4 PCR反應(yīng) 取上述反應(yīng)產(chǎn)物，根據(jù)軟件設(shè)計(jì)B7-1引物(序列號(hào)X60958.1)，上游：5′-CGGAATTCATGGCTTGCAATTGTCA-3′，下游：5′-GCGGATCCCTAAAGGAAGACGGT -CT-3′；CD1D引物(序列號(hào)NM 007639)：上游：5′-CGGAATTCGCTATGCGGTACCTACC-3′，下游：5′-GCGGATCCGTGTAAGGAAGAGTCAC-3′，反應(yīng)體系包括：引物、RT產(chǎn)物、TaqDNA酶、dNTP等；加水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5 min。反應(yīng)完畢，將產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.5 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 對(duì)產(chǎn)物用EcorRⅠ和BamHⅠ雙酶切，經(jīng)凝膠純化后已同樣經(jīng)過(guò)酶切和純化的pcDNA3質(zhì)粒在T4連接酶的作用下，16℃連接過(guò)夜，產(chǎn)物進(jìn)行電泳，切下所需條帶純化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，挑取單克隆菌落進(jìn)行篩選，然后用雙酶切方法加以鑒定。

2 結(jié)果

2.1 小鼠脾總RNA的提取

用Trizol試劑提取小鼠總RNA，溶于20 μLDEPC處理過(guò)的雙蒸水中，取4 μL進(jìn)行凝膠電泳，可見(jiàn)兩條明顯的RNA條帶。用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA OD260/OD280為1.89，能滿足實(shí)驗(yàn)的要求(見(jiàn)圖1)。

圖1 小鼠總RNA凝膠電泳

2.2 CD1D基因與B7-1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

小鼠總RNA用試劑盒方法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，分別可見(jiàn)CD1D基因大小為1 010bp的條帶(見(jiàn)圖2)和B7-1基因大小為930bp的條帶(見(jiàn)圖3)，測(cè)序結(jié)果與已知系列相符。

圖2 CD1D基因的PCR檢測(cè)1.空白對(duì)照；2.DNA marker DL2 000，從上至下分子量為2 000、1 000、750、500、250、100；3.CD1D基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1 010bp)

圖3 B7-1基因的PCR檢測(cè)1.空白對(duì)照；2.DNA marker DL2 000，從上至下分子量為2 000、1 000、750、500、250、100；3.B7-1基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(930bp)

2.3 重組載體的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取單克隆菌落用EcorRⅠ和BamHⅠ雙酶切，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳加以鑒定，可見(jiàn)1條1 000bp和1條5.4kb的條帶，與已知片段分子量大小相符，獲得重組的真核表達(dá)載體(見(jiàn)圖4)。

圖4 CD1D基因與B7-1基因真核表達(dá)載體的酶切鑒定1.DNA marker；2.CD1D基因真核表達(dá)載體的酶切鑒定；3.B7-1基因真核表達(dá)載體的酶切鑒定

3 討論

研究顯示，CD1D的抗原呈遞途徑不同于已知的MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ類所介導(dǎo)的抗原傳遞途徑，能在體內(nèi)通過(guò)調(diào)控Ⅰ型和Ⅱ型NK細(xì)胞，誘導(dǎo)多種免疫排斥反應(yīng)，與自身免疫性疾病，腫瘤等疾病密切相關(guān)[2]，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)外學(xué)者通過(guò)對(duì)CD1D依賴型細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)CD1D分子可以大量激活有生物活性的IL-12、IFN-γ等免疫炎性物質(zhì)，引起細(xì)胞裂解，提高細(xì)胞抵抗病毒的能力[3]。此外，CD1D基因還可以通過(guò)介導(dǎo)呈遞抗原途徑，誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，提高機(jī)體抗骨髓瘤的能力[4]。CD1D在脂類抗原的識(shí)別中居于十分重要的地位，通過(guò)導(dǎo)入CD1D基因可能對(duì)免疫基因治療在臨床治療上開(kāi)辟一種新的基因治療模式。

機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞免疫過(guò)程，T細(xì)胞在腫瘤排斥及對(duì)腫瘤產(chǎn)生特異性記憶中起著重要作用，T細(xì)胞的激活存在雙信號(hào)作用機(jī)制，需要第一信號(hào)及第二信號(hào)的參與。一是由T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的抗原特異性信號(hào)即第一信號(hào)，另一個(gè)是由B7分子等共刺激分子介導(dǎo)的抗原非特異性信號(hào)即第二信號(hào)。正常狀態(tài)下，由于抗原肽分子數(shù)量較少，難以刺激產(chǎn)生第一信號(hào)，往往需要免疫細(xì)胞依靠B7等共刺激分子介導(dǎo)第二信號(hào)來(lái)擴(kuò)大反應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)，活化免疫細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。B7-1是在T細(xì)胞活化中提供第二信號(hào)的關(guān)鍵分子，能通過(guò)與T細(xì)胞上CD28/CTLA-4反應(yīng)為T細(xì)胞活化提供協(xié)同刺激信號(hào)，其在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)，能協(xié)同激活CD8+CTL以及CD4+T細(xì)胞。

許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，單基因治療在降低腫瘤的致瘤性，提高腫瘤的免疫原性方面難以達(dá)到預(yù)期的效果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷成熟, 很多的研究顯示雙基因及多基因聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞可以達(dá)到更佳的治療效果[5]。如聯(lián)合MCP-1、GM-CSF、B7-1所制備的細(xì)胞疫苗，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了明顯的抗腫瘤效應(yīng)[6]。聯(lián)合同一免疫反應(yīng)途徑中兩個(gè)刺激因子，能夠優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，產(chǎn)生更明顯的共刺激信號(hào)以加強(qiáng)抗腫瘤免疫的效果[7]。

真核載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是將外原性基因?qū)氚屑?xì)胞的有效手段，能高效地將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組，是基因治療的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究中廣泛使用的載體系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)成功克隆和構(gòu)建了小鼠CD1D和B7-1基因的真核表達(dá)載體，今后我們將利用這些載體，在小鼠胰腺癌細(xì)胞中導(dǎo)入B7-1和CD1D基因，這種修飾過(guò)的胰腺癌細(xì)胞有望能增強(qiáng)共刺激分子在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)，有助于機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和排斥并提高機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別能力, 從而激發(fā)CTL的活性，降低細(xì)胞的致瘤性，有可能是一種極有前途的腫瘤細(xì)胞疫苗。

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