林妙端 陳建森 佘菲菲 陳 豪

(福建醫(yī)科大學病原生物學系福建省感染與腫瘤重點實驗室,福州350004)

幽門螺桿菌(Hp)感染是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍的主要病因,并與胃腺癌和胃粘膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關[1]。全世界約有50%的人患有 Hp相關性胃腸疾病,聯(lián)合應用質子泵抑制劑和抗生素的三聯(lián)療法是目前控制 Hp感染的主要方案,但存在細菌耐藥,抗生素治療后細菌的球形變異、藥物不良反應及藥效經濟學等問題[2]。因此,研制 Hp疫苗是預防和治療Hp感染切實有效的方法。近年有關核酸疫苗的研究倍受關注。核酸疫苗作為一種新型疫苗,能使機體對質粒所編碼抗原產生強烈而持久的體液免疫應答和細胞免疫應答,具有安全,高效,成本相對較低,性質比較穩(wěn)定等優(yōu)點[3]。

oipA(outer inflammatory protein)基因編碼前炎癥外膜蛋白,相對分子質量為34 kD,是一種較強的Hp致病基因,特別在 Hp感染的炎癥過程中起著重要的作用。許多研究表明,OipA與活動性胃炎、消化性潰瘍、胃癌有明顯的相關性[4,5]。我們以往的研究結果表明oipA DNA重組質粒,經肌注途徑免疫,具有抗 Hp的免疫保護作用,但是保護率較低,僅50%[6]。本研究對oipA基因序列進行密碼子優(yōu)化,K ozak前導序列添加、CpG序列優(yōu)化,擬構建攜帶oipA優(yōu)化基因真核表達載體的SL7207重組菌株,并研究其對C57BL/6小鼠抗 Hp感染的免疫保護作用,以獲得高效的口服疫苗。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞株及質粒 幽門螺桿菌國際標準株J99及SS1株購自中國疾病預防控制中心傳染病研究所;大腸桿菌DH5α(Invitrogen公司);鼠傷寒沙門菌LB5000和aroA基因缺陷的減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207由本實驗室保存;胃腺癌細胞系(AGS)購自中科院上海細胞庫;真核表達載體pVAX1(Invitrogen公司)。

1.2 實驗動物 C57BL/6小鼠60只,6周齡,雌性,體重(18±2)克,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,實驗動物質量合格證號為0056435,福建醫(yī)科大學動物實驗室SPF級小鼠飼養(yǎng)室飼養(yǎng),許可證號為SYXK(閩)2008-0001,適應性飼養(yǎng)1周后用于免疫實驗。

1.3 pVAX1-oipA重組子的構建 從 GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取 HpJ99 oipA全長基因序列(基因號：NC 000921),應用DNAMAN分析基因和pVAX1的酶切圖譜,應用Oligo 6軟件設計引物序列,在上游引物的的5′端引入 PstⅠ酶切位點,下游引物的3′端引入XhoⅠ酶切位點,引物由上海博尚生物技術有限公司合成 ,序列如下 ：oipA-F：5′-AAAACTGCAGATG AAAAAAGTCCTCTTACTAAC-3′;oipA-R ：5′-CCGCTCG AGTTAATGTTTGTTTTTTAAAGTTA-3′。以 提 取 的J99基因組為模板,用上述合成的引物進行PCR擴增。反應條件：94℃2分鐘;(94℃30秒,54℃45秒,72℃90秒)×30;72℃7分鐘。取25μl PCR產物(924 bp)電泳回收后,用PstⅠ和XhoⅠ對目的基因和載體pVAX1進行雙酶切,將目的基因和經過CIP處理過的載體pVAX1連接后轉化入DH5α感受態(tài)細胞中,在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng),隨機挑取單克隆菌落過夜培養(yǎng),小量提取質粒進行PCR,酶切鑒定,并將初步鑒定含陽性重組子的細菌克隆送上海博尚生物技術有限公司進行序列測定。

1.4 oipA基因序列的優(yōu)化和pVAX1-optioipA重組子的構建 在保持oipA基因全部氨基酸不變的原則下,由上海生工生物工程技術服務有限公司應用軟件將其密碼子改為小鼠偏愛的密碼子,進行 CpG序列優(yōu)化,并在基因的上游引入PstⅠ酶切位點以及K ozak序列,下游引入XhoⅠ酶切位點,最后將合成的oipA優(yōu)化基因(942 bp)重組入真核表達載體pVAX1,命名為pVAX1-optioipA。

1.5 重組子瞬時轉染AGS細胞 將含重組子和空質粒的菌體大規(guī)模培養(yǎng),用Qiagen Plasmid Midi K it提取pVAX1-oipA,pVAX1-optioipA,pVAX1,調整濃度為1 mg/ml。應用含10%胎牛血清(FBS)的F12培養(yǎng)基(Sigma公司),37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)AGS細胞,至對數(shù)生長期以0.25%的胰蛋白酶消化細胞,計數(shù)并轉種入6孔板,5×105/孔,培養(yǎng)約24小時至細胞密度為90%～95%。更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基,分別取4μg質粒按比例與LipofectamineTM2000(In-vitrogen公司)和不含 FBS的培養(yǎng)基混合,室溫孵育20分鐘后均勻加入AGS細胞培養(yǎng)孔中,5小時后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時,棄去上清液,細胞以RIPA裂解液(碧云天公司)裂解,裂解細胞溶液放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Western印跡法檢測表達蛋白免疫原性 BCA法測定三組蛋白濃度后,取裂解細胞溶液加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10分鐘后,以相同蛋白量上樣,采用12%SDS-PAGE進行電泳,轉移至硝酸纖維素膜(NC膜),3%牛血清白蛋白(BSA)封閉4小時,加入兔抗oipA抗體(Abmart公司為本室制備)4℃孵育過夜,洗滌3次后加AP標記的羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物公司)室溫孵育2小時,洗滌3次后涂CDP-Star,曝光,顯影,掃描。

1.7 重組減毒鼠傷寒沙門菌核酸疫苗構建和穩(wěn)定性檢測 挑取減毒鼠傷寒沙門菌SL7207單個菌落于LB培養(yǎng)液中振蕩(200 r/min)培養(yǎng)過夜,按1∶100接種500μl菌液于50 ml LB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至OD值至0.6～0.7,用滅菌雙蒸水洗滌1次后再用10%滅菌甘油洗滌2次(4℃,4 000 r/min,10分鐘),最后加入2 ml 10%滅菌甘油重懸菌制成SL7207感受態(tài)細胞,分裝后放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過氯化鈣法將重組子pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,和空質粒pVAX1轉入鼠傷寒沙門菌LB5000,提取經過甲基化修飾的pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,pVAX1分別加入80μl SL7207感受態(tài)細胞,冰浴5分鐘后轉移至電擊杯(1 mm)中 ,電轉化條件：2 000 V電壓,25μF電容,200Ω電阻,放電時間4～5秒。電擊后將轉化液加入1 ml LB培養(yǎng)中靜置培養(yǎng)2小時,吸取100μl培養(yǎng)液接種于LB平板(50μg/ml卡那霉素)中37℃培養(yǎng)過夜,挑取陽性克隆抽提質粒進行鑒定,培養(yǎng)制備成疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,和空質粒菌SL7207/pVAX1,用滅菌的PBS調成2.5×109CFU/ml備用。將構建好的SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,在卡那霉素(+)和卡那霉素(-)的LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傳代50次,每10代提取一次質粒,酶切鑒定。

1.8 重組減毒鼠傷寒沙門菌核酸疫苗的免疫保護作用

1.8.1 口服免疫小鼠 小鼠隨機分成5組：①PBS組(10只);②SL7207組(10只);③SL7207/pVAX1組(10只);④SL7207/pVAX1-oipA疫苗組(15只);⑤SL7207/pVAX1-optioipA疫苗組(15只)。小鼠禁食一夜,禁水4小時,先以無菌3%NaHCO3100μl灌胃以中和胃酸,30分鐘后再予 200μl菌液(5×108CFU/只)灌胃,PBS對照組予200μl PBS,2小時后恢復飲食、飲水。2周后加強免疫一次。

1.8.2 間接ELISA法測小鼠血清中抗 HpoipA特異性抗體 末次免疫2周后從小鼠眼內眥采血制備血清。以終濃度為5μg/ml的oipA抗體(Abmart公司為本室合成)包被96孔酶標板,100μl/孔,4℃過夜,PBS(含3%BSA)37℃封閉2小時,以含 0.05%Tween 20的PBS緩沖液(PBST)洗滌后加待測血清(1∶100),每份標本均測3個復孔,37℃孵育2小時,洗滌后加HRP標記羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司1∶500),37°C孵育2小時,洗滌后于各反應孔中加入臨時配制TMB底物反應液,室溫放置30分鐘顯色,加入反應終止液(2 mmol/L H2SO4),于OD490nm波長測定各反應孔OD值,以oipA抗體為陽性對照,3%BSA/PBST孔做陰性對照調零。血清抗 HpoipA IgG抗體濃度以OD490表示。

1.8.3 Hp攻擊免疫小鼠后胃組織細菌學檢測 末次免疫4周后,以 HpSS1株菌液(5×108CFU/只)灌胃攻擊,隔天1次,共3次。末次攻擊4周后,禁食24小時,處死小鼠,無菌取胃,沿胃大彎剪開,用生理鹽水漂洗后,取一小塊胃粘膜行快速尿素酶試驗,另取胃組織采用半定量細菌培養(yǎng)法,胃組織稱重后,制成勻漿 ,用布氏肉湯 1∶10、1∶100、1∶1 000 倍比稀釋后,各取100μl涂于布氏血瓊脂平板上,37℃微需氧條件下(5%O2、10%CO2、85%N2)培養(yǎng) 3～5 天 ,細菌作快速尿素酶(三強生物化工有限公司)試驗,涂片革蘭氏染色鏡檢及PCR鑒定(用上述oipA引物)。鑒定正確后進行菌落計數(shù),計算單位胃組織的定植細菌密度。

1.9 統(tǒng)計學處理 各組間率的比較用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行Fisher精確檢驗,計量資料以±s表示,各組之間進行One Way Anova檢驗,以P＜0.05和P＜0.01提示差異顯著和極顯著。

2 結果

2.1 真核表達載體的構建及鑒定 以 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA為模板利用上述引物PCR擴增出大約為1 kb的片段(圖1);應用 PstⅠ/Xho Ⅰ分別酶切pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA,經 1%瓊脂糖凝膠電泳顯示雙酶切后,可見釋放目標片段,目標片段約1 kb(圖2);pVAX1-oipA序列測定(上海博尚生物技術有限公司)結果顯示其核酸序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫公布的 HpJ99 oipA全長基因序列完全一致,pVAX1-optioipA序列測定(上海生工生物工程技術服務有限公司)與本研究原先設計的核酸序列完全一致,證明已成功構建了pVAX1-oipA,pVAX1-optioipA重組子。

2.2 目的基因在AGS細胞中表達的檢測 Western印跡法結果顯示：在 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA、pVAX1瞬時轉染AGS細胞48小時后,細胞裂解液能檢測到OipA蛋白(34 kD)的表達。而空載體pVAX1未見目的蛋白條帶。與pVAX1-oipA相比,pVAX1-optioipA蛋白表達量較高(圖3),這證明經過密碼子優(yōu)化,K ozak前導序列添加等優(yōu)化措施可以提高OipA蛋白在真核細胞中的表達量。

圖1 重組質粒pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA PCR鑒定Fig.1 Identification of pVAX1-oipA、pVAX1-optioip A recombinant plasmid by PCR

圖2 重組質粒pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA的酶切鑒定Fig.2 Identification of pVAX1-oipA,pVAX1-optioip A recombinant plasmid by digestion with restriction enzymes PstⅠand XhoⅠ

圖3 pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA表達OipA蛋白的 Western印跡圖Fig.3 Western blot analysis of OipA protein expressed by pVAX1-oipA,pVAX1-optiopA

圖4 重組減毒鼠傷寒沙門菌核酶疫苗的酶切鑒定Fig.4 Identification of Attenuated Salmonella typhimurium containing recombinant plasmid by digestion with restriction enzymes PstⅠand XhoⅠ

2.3 重組減毒鼠傷寒沙門菌核酸疫苗構建和鑒定重組疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA、SL7207/pVAX1-

optioipA和空質粒菌SL7207/pVAX1抽提質粒,經電泳后均獲得相應的電泳條帶,重組疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA抽提質粒經PstⅠ/XhoⅠ酶切后獲得一條約1 kb的電泳條帶,其大小與oipA全長序列相符(圖4),重組疫苗菌SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA血清凝集試驗結果均為A-F多價、O4菌體和H1鞭毛抗原陽性。證明成功構建攜帶Hp oipA基因和oipA優(yōu)化后基因真核表達載體的SL7207重組菌株。將構建好的SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA,在卡那霉素(+)和卡那霉素(-)的LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傳代50次,每10代提取一次質粒,酶切鑒定結果都能獲得一條約1 kb的電泳條帶,其大小與oipA全長序列相符,證明在沒有抗生素選擇壓力下重組減毒沙門氏菌能保持其穩(wěn)定性。

表1 小鼠血清抗 HpoipA特異性抗體ELISA檢測結果Tab.1 The result of ELISA detected the mice serum anti-Hp oipA antibodies

表2 小鼠胃組織細菌學檢測結果Tab.2 The result of bacteriology test of gastric mucosa

2.4 間接ELISA法測小鼠血清中抗 HpoipA特異性抗體結果 口服免疫2周后,小鼠血清抗 HpoipA特異性抗體 ELISA檢測結果見表1,疫苗接種組(SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA)小鼠血清中抗oipA抗體的OD值顯著高于對照組(P＜0.01),表明了oipA在體內表達了相應的蛋白,該蛋白具有刺激機體產生免疫應答的免疫原性。其中SL7207/pVAX1-optioipA疫苗組小鼠血清中抗oipA抗體的OD值顯著高于SL7207/pVAX1-oipA疫苗組(P＜0.01),推測經過優(yōu)化的oipA基因其蛋白在小鼠體內得到較高水平的表達。

2.5 免疫保護實驗結果 Hp感染的科研診斷標準是:Hp培陽性或Hp形態(tài)學、尿素酶依賴試驗、血清學試驗、特異性PCR,4項中任2項陽性,即可判定為 Hp感染陽性。本實驗采用小鼠胃粘膜組織快速尿素酶試驗及細菌定量培養(yǎng)來檢測 Hp感染狀況,結果見表 2。疫苗接種組(SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA)的Hp感染率顯著低于對照組(P＜0.01)。其中SL7207/pVAX1-oipA疫苗組的Hp感染率為60%,SL7207/pVAX1-optioipA疫苗組的Hp感染率為26.67%,對感染陽性的小鼠,我們進行了 Hp定植密度的分析,發(fā)現(xiàn)3組對照組 Hp的定植密度都在105CFU/g以上,明顯高于疫苗接種組(P＜0.01),其中 SL7207/pVAX1-oipA疫苗組 Hp定植密度高于 SL7207/pVAX1-optioipA疫苗組(P＜0.01),表明oipA核酸疫苗對 Hp感染小鼠具有一定的免疫保護作用,優(yōu)化oipA基因有助于提高免疫保護的效果。

3 討論

核酸疫苗是繼減毒、滅活和亞單位疫苗之后的第3代疫苗,被譽為預防醫(yī)學領域的第3次疫苗革命。與以往的減毒、滅活等蛋白疫苗相比,核酸疫苗雖然具有無法比擬的優(yōu)點,但仍需優(yōu)化。針對目前的技術水平來說,沒有修飾的裸露DNA質粒,轉染細胞后蛋白的表達不夠理想,誘導的免疫反應較弱,因此為了得到更理想的免疫效果,進行核酸疫苗的優(yōu)化是十分必要的[3]。

核酸疫苗主要由保護性抗原及真核表達載體構成,保護性抗原的篩選是構建核酸疫苗的關鍵,我們實驗室以往的研究結果表明編碼OipA蛋白的核酸疫苗肌注BALB/c小鼠具有抗 Hp的免疫保護作用,但是保護效率比較低[6]。究其原因,可能與機體細胞吸收核酸疫苗的效率很低,抗原表達量少,難以達到足夠的免疫刺激劑量有關。對于疫苗而言,抗原蛋白的表達水平對其免疫原性起著十分關鍵的作用[7]。而提高核酸疫苗在機體中抗原的表達,其中重要的環(huán)節(jié)之一是通過抗原密碼子優(yōu)化。細菌、植物、動物各有自己偏好的密碼子,對已知氨基酸序列的抗原來說,可以通過優(yōu)化密碼子,使用宿主偏好的密碼子,從而提高抗原在宿主中的表達水平。有相當多的文獻報道,抗原基因密碼子的優(yōu)化可以顯著的改善蛋白的表達效率[8,9]。另一環(huán)節(jié)可以通過K ozak前導序列添加來提高抗原表達量。K ozak序列是 K ozak M發(fā)現(xiàn)的,他詳細研究了起始密碼子ATG周邊堿基定點突變后對轉錄和翻譯所造成的影響,并總結出在真核生物中,起始密碼子周邊序列為CCACCATGG時轉錄和翻譯效率最高,該序列被廣泛應用于真核表達載體的構建中。謝慶軍等[10]在人p53腫瘤抑制基因編碼區(qū)前設計了一個K ozak序列,從而在蛋白翻譯水平提高基因的表達量。

近年來研究證實減毒鼠傷寒沙門菌是良好的重組質粒承載系統(tǒng),作為疫苗載體接種安全無毒,效果優(yōu)于直接接種抗原蛋白或重組質粒,且無需其他粘膜免疫佐劑(佐劑均有一定不良反應),具有廣闊的應用前景[11]。隨著對沙門菌毒力遺傳以及重組DNA技術的深入了解,已經研制出許多遺傳確定的新型弱毒傷寒株作為口服活疫苗的候選菌株,其中研究最廣泛的是營養(yǎng)缺陷型弱毒株如aro基因缺失株,cya/crp基因缺失株,Dam和phoP/phoQ基因缺失株等[12]。本研究采用aroA基因缺陷的減毒鼠沙門菌SL7207為載體,aroA編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶,該酶催化2,4-二羥基苯甲酸鹽的分支酸途徑的中間反應,產生芳香族氨基酸。而哺乳動物不具備該合成途徑,故細菌從宿主體內獲得這些化合物的可能性極小,使得aroA突變株在體外培養(yǎng)時依賴上述化合物生長,但在宿主體內只能有限生長繁殖從而得到減毒。國內外學者廣泛選用減毒鼠沙門菌SL7207作為核酸疫苗的載體菌[13-15]。

為了提高oipA核酸疫苗抗 Hp的免疫保護作用,研制高效的 Hp疫苗,本研究對oipA基因進行了一系列優(yōu)化,包括添加了 GCCACC前導序列,選擇小鼠偏愛的密碼子,并合理調整CG的含量達到CpG序列優(yōu)化,以期通過提高抗原在宿主中的表達水平,同時發(fā)揮CpG免疫佐劑的作用,提高宿主對oipA核酸疫苗的免疫應答進而提高oipA核酸疫苗抗 Hp的免疫保護作用。本實驗將oipA基因和oipA優(yōu)化基因克隆入 pVAX1真核表達載體,獲得重組子pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA。因為人類、嚙齒類以及豬這3種哺乳動物對絕大多數(shù)密碼子的偏嗜性是相同或相似[16],所以采用人胃腺癌AGS細胞對重組子的表達進行體外檢測。將上述重組子與空載體pVAX1一起瞬時轉染人胃腺癌AGS細胞,應用Western blot檢測轉染細胞中優(yōu)化前后OipA蛋白的表達,研究發(fā)現(xiàn)pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA均可在AGS細胞中表達,且pVAX1-optioipA蛋白表達量高于pVAX1-oipA。在驗證了重組子表達蛋白的基礎上,將pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA轉入減毒鼠沙門菌SL7207,經過鑒定制成穩(wěn)定的口服核酸疫苗。最后體內實驗表明,優(yōu)化后的oipA基因在小鼠體內表達的蛋白量高于未優(yōu)化的oipA基因,小鼠接種疫苗菌后均獲得一定的免疫保護,Hp感染率明顯低于對照組,而 Hp感染的疫苗組小鼠胃組織中Hp定植密度顯著降低,其中優(yōu)化后oipA核酸疫苗組獲得更好的免疫保護效果。

綜上所述,本研究成功構建了攜帶 HpoipA核酸疫苗和優(yōu)化后oipA核酸疫苗的SL7207重組菌株,體外實驗證實其可表達具有免疫原性的抗原蛋白,體內實驗證實其對小鼠 Hp感染具有免疫保護性,優(yōu)化oipA基因可提高核酸疫苗的免疫保護效果,這為對 Hp核酸疫苗作更深入的實驗研究及其臨床應用奠定了基礎。

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