冷雪榮 吳 曄 潘艷霞 杜 麗 金 洪 王靜敏 姜玉武

白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病(leukoencephalopathy with vanish-ing white matter，VWM)是一種常染色體隱性遺傳的白質(zhì)腦病，是兒童期常見(jiàn)的遺傳性白質(zhì)腦病之一[1]。VWM是由編碼真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子2B(eukaryotic translation initiation factor 2B，eIF2B)的5個(gè)亞單位(eIF2Bα、β、γ、δ、ε)的相應(yīng)編碼基因EIF2B1～5的任一突變引起[2]。eIF2B為5個(gè)亞單位構(gòu)成的五聚體復(fù)合物，其中eIF2Bε是重要的亞單位，具有鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移因子(guanine nucleotide-exchange factor, GEF)活性，直接作用對(duì)象為真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子2 (eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2)，催化eIF2-GDP向eIF2-GTP轉(zhuǎn)化；其他4個(gè)eIF2B亞單位在調(diào)控GEF活性方面具有重要作用。

目前，VWM臨床診斷主要依據(jù)典型的臨床表現(xiàn)以及頭顱MRI特點(diǎn)，確診需經(jīng)基因突變分析。本研究對(duì)臨床診斷并經(jīng)基因突變分析確診的中國(guó)VWM患兒進(jìn)行臨床特征總結(jié)，對(duì)基因突變特點(diǎn)進(jìn)行分析，并做初步的突變功能研究。以期提高兒科醫(yī)生對(duì)該病的認(rèn)識(shí)，并為進(jìn)一步的遺傳咨詢及了解VWM發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) VWM依據(jù)van der Knaap等推薦的標(biāo)準(zhǔn)[3]：①早期的精神、運(yùn)動(dòng)發(fā)育基本正?；蜉p度落后；②兒童早期出現(xiàn)進(jìn)行性加重的神經(jīng)系統(tǒng)功能倒退，發(fā)熱或輕微頭部外傷均引起病情加重；③神經(jīng)系統(tǒng)癥狀主要包括小腦共濟(jì)失調(diào)，肢體痙攣；④頭顱MRI表現(xiàn)為彌漫性、對(duì)稱性大腦白質(zhì)廣泛受累，累及中央?yún)^(qū)及皮質(zhì)下白質(zhì)，白質(zhì)異常在T1、T2及FLAIR像上逐漸演變?yōu)榕c腦脊液相同的信號(hào)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 以臨床診斷為VWM的患兒為研究對(duì)象。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①常見(jiàn)有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸和線粒體代謝病；②已知常見(jiàn)的其他遺傳性白質(zhì)腦??；③后天獲得性白質(zhì)病變(腦室旁白質(zhì)軟化和急性播散性腦脊髓炎等)。

1.4 倫理審核 本研究方案經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)審批，所有患兒家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.5 臨床資料收集 包括：病史及體格檢查；血生化(電解質(zhì)、血氨、乳酸、丙酮酸及肝、腎功能)檢查；尿有機(jī)酸、氨基酸及脂肪酸分析結(jié)果；白細(xì)胞芳香硫脂酶A和β半乳糖腦苷脂酶活性測(cè)定結(jié)果；頭顱MRI片。

1.6 基因突變分析

1.6.1 提取外周血白細(xì)胞DNA 采集患兒及其父母外周靜脈血各5 mL，抗凝，以常規(guī)鹽析法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.6.2 突變篩查 國(guó)際上報(bào)道VWM的120多種突變中[4]，EIF2B5突變最為常見(jiàn)，占57%。EIF2B2突變占15%，EIF2B4突變占17%，EIF2B3突變占7%，EIF2B1突變僅占4%[5，6]。因此，對(duì)于每例患兒首先篩查EIF2B5突變，隨后依次篩查EIF2B4、EIF2B2、EIF2B3和EIF2B1突變。PCR擴(kuò)增包括EIF2B5的16 個(gè)外顯子,EIF2B4的13個(gè)外顯子，EIF2B2的8個(gè)外顯子，EIF2B3的12個(gè)外顯子，EIF2B1的9個(gè)外顯子，以及所有外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PAGE檢測(cè)，在ABI 3100 測(cè)序儀上直接正反向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNASTAR 軟件分析。對(duì)于本研究發(fā)現(xiàn)的國(guó)外未報(bào)道的新突變，通過(guò)分析氨基酸變化、保守性、家系傳遞分離分析、已知基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及100例健康成人對(duì)照的測(cè)序，以確定所發(fā)現(xiàn)的突變?yōu)橹虏⊥蛔儯懦蚨鄳B(tài)性。并對(duì)其父母進(jìn)行基因測(cè)序，分析突變來(lái)源。

1.7EIF2B5突變功能研究

1.7.1 突變的選擇 選擇在患兒中發(fā)現(xiàn)的EIF2B5基因的新突變進(jìn)行功能研究。

1.7.2 質(zhì)粒構(gòu)建 將帶有野生型人類(lèi)eIF2Bε全長(zhǎng)cDNA的 PHM表達(dá)質(zhì)粒(加拿大Southampton大學(xué)Proud教授饋贈(zèng))，利用QuikChange Site-directed Mutagenesis 試劑盒(Stratagene公司)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得突變體質(zhì)粒。N端具有 Hexahistidine (His6)和 Myc標(biāo)記，以便于檢測(cè)蛋白表達(dá)。所有的cDNA均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

1.7.3 培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞 將HEK 293細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃和5%CO2條件下孵育。每2 天換液1次。利用lipofecta-mine2000試劑盒(Invitrogen公司)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染野生型及突變型質(zhì)粒，48 h后提取細(xì)胞總蛋白。

1.7.4 提取蛋白 用冰冷的PBS洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞裂解液(50 mmol·L-1Tris HCl，50 mmol·L-1beta-glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate，1 mmol·L-1EDT，1 mmol·L-1EGTA，1% Triton X-100)直接加入細(xì)胞中，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全裂解。分別將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至EP管，4℃，13 000 r·min-1離心10 min。吸取上清蛋白，-80℃保存。

1.7.5 Western blot分析突變蛋白表達(dá) 將蛋白標(biāo)本加入等體積2× SDS sample buffer，95℃加熱5 min。在8% SDS-PAGE分離，每條泳道蛋白上樣量20 μg，每次電泳包括野生型和突變型的蛋白標(biāo)本。電泳結(jié)束后，用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素(NC)膜上。轉(zhuǎn)移后的NC 膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(Anti-myc，Sigma公司)，4℃過(guò)夜。用TTBS 洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(山羊抗兔IgG，北京中山生物技術(shù)公司)，室溫孵育1 h，TTBS 充分洗膜，通過(guò)魯米諾化學(xué)發(fā)光法暴光Kodak 膠片，顯示目的條帶。以β-actin作為內(nèi)參，同一組的目的條帶灰度與β-actin相比，計(jì)算相應(yīng)比值，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2006至2008年于北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科神經(jīng)科臨床診斷為VWM患兒12例，其中男8例，女4例。臨床及頭顱MRI表現(xiàn)符合VWM的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。父母均非近親婚配，患兒間無(wú)親緣關(guān)系。臨床特征見(jiàn)表1。

2.3 輔助檢查特點(diǎn) 頭顱MRI均呈典型改變：彌漫性、對(duì)稱性大腦白質(zhì)受累，以中央?yún)^(qū)白質(zhì)為著，在T1加權(quán)像、T2加權(quán)像及FLAIR像，受累白質(zhì)表現(xiàn)為接近或等于腦脊液信號(hào)(圖1)。所有患兒其他輔助檢查均未見(jiàn)明顯異常。

圖1 VWM患兒(例1)的頭顱MRI片

Fig 1 Brain MRI from patient 1 with VWM

Notes A:T2-weighted;B:T1-weighted;C:FLAIR;Symmetric and diffuse signal abnormalities in periventricular and subcortical white matter were shown, with low signals in T1-weighted image and FLAIR image, and high signals in T2-weighted image, similar to that of cerebrospinal fluid

2.4 基因突變分析 12例患兒中發(fā)現(xiàn)16種基因突變。其中6例患兒為EIF2B5突變，5例為EIF2B3突變，1例為EIF2B2突變。16種基因突變中包括9種國(guó)際上未報(bào)道的新突變和7種已知突變。7種已報(bào)道的突變?yōu)镋IF2B5：c.943C>T (p.R315C)、c.1340C>T(p.S447L)、c.1016G>C(p.R339P)、c.1157G>T(p.G386V)、c.337C>T(p.R113C)、c.806G>A(p.R269Q)；EIF2B3：c.674G>A(p.R225Q)。9種新突變中7種錯(cuò)義突變?yōu)镋IF2B5：c.185A>T(p.D62V)、c.1004G>C(p.C335S)、c.1126A>G(p.N376D)；EIF2B3：c.140G>A(p.G47E)、c.1037T>C(p.I346T)；EIF2B2：c.254T>A(p.V85E)、c.922G>A(p.V308M)； 1種無(wú)義突變?yōu)镋IF2B5： c.805C>T(R269X)；1種缺失突變?yōu)镋IF2B5：c.1827-1838del(p.S610-D613del)(表1，圖2)。9種新突變均位于進(jìn)化上的高度保守區(qū)，未在100例健康成人對(duì)照中發(fā)現(xiàn)。1例患兒(例10)僅在一個(gè)等位基因上發(fā)現(xiàn)了突變，另一個(gè)等位基因的編碼區(qū)以及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變。所有患兒的突變均來(lái)自表型正常的父母。

圖2 9種EIF2B新突變的測(cè)序圖譜

Fig 2 The chromatograms of sequencing results of 9 novelEIF2Bmutations

Notes A:EIF2B3，c.140G>A, p.G47E ;B:EIF2B3，c.1037T>C, p.I346T (reverse sequencing);C:EIF2B5，c.1126A>G, p.N376D；D:EIF2B5,c.1004G>C, p.C335S;E:EIF2B5,c.805C>T, p.R269X(reverse sequencing);F:EIF2B5,c.185A>T, p.D62V;G:EIF2B5,c.1827-1838del,p.S610-D613;H:EIF2B2,c.254T>A,p.V85G;I:EIF2B2,c.922G>A,p.V308M

2.5EIF2B5突變功能研究EIF2B5新突變p.D62V、p.R269X、p.C335S、p.N376D和p.S610-D613del 中，p.R296X和p.S610-D613del突變引起蛋白表達(dá)量顯著降低，Western blot幾乎檢測(cè)不到條帶(圖3)。其他3個(gè)錯(cuò)義突變p.D62V、p.C335S和p.N376D蛋白表達(dá)量與野生型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 5種EIF2B5突變對(duì)eIF2Bε蛋白表達(dá)量的影響

Fig 3 Effects of fiveEIF2B5 mutations on the mutant eIF2Bε protein expression

Notes HEK 293 cells were transfected with wild-type or mutant eIF2Bε cDNA, lysates were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylam gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. On immunoblots, eIF2Bε-p.D62V, eIF2Bε-p.C335S and eIF2Bε-p.N376D were present in amounts similar to the wild type, whereas eIF2Bε-R269X and eIF2Bε-S610-D613Sdel were present in a substantially reduced amount, which almost could not be detected

3 討論

VWM是兒童期起病的遺傳性白質(zhì)腦病中常見(jiàn)的類(lèi)型之一。VWM臨床表型差異很大，起病年齡可早至胎兒期(先天型，1歲內(nèi)死亡)或晚至成年期(成年型)，其中以1～5歲起病最為多見(jiàn)(早期兒童型，又稱經(jīng)典型)。早期兒童型VWM患兒發(fā)病前智力和運(yùn)動(dòng)發(fā)育多正常，少數(shù)有輕度運(yùn)動(dòng)或語(yǔ)言發(fā)育落后。起病表現(xiàn)多為共濟(jì)失調(diào)，逐漸出現(xiàn)肢體痙攣、構(gòu)音障礙和驚厥，在病程后期可出現(xiàn)吞咽困難，智力受累相對(duì)較輕。臨床特征性表現(xiàn)為遇輕微感染(如上呼吸道感染)所致發(fā)熱或輕微頭部外傷后即可引起病情明顯加重，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能喪失，可伴易激惹、嘔吐、意識(shí)障礙，甚至驚厥及昏迷，病程中可逐漸緩慢恢復(fù)，發(fā)作也可導(dǎo)致死亡。VWM患兒的病程變化個(gè)體差異較大，多于起病后數(shù)年內(nèi)死亡，也有存活數(shù)十年的報(bào)道[7]。本組12例患兒根據(jù)起病年齡均屬于早期兒童型。至末次隨訪，病程為9個(gè)月至7年，所有患兒均存活。本病典型體征主要為錐體束征陽(yáng)性，可伴有共濟(jì)失調(diào)體征，頭圍多正常。本病頭顱MRI具有較獨(dú)特的特征，大腦白質(zhì)病變顯著重于其他遺傳性白質(zhì)腦病，表現(xiàn)為彌漫性、對(duì)稱性大腦白質(zhì)的液化樣改變，即“白質(zhì)消融”，以中央?yún)^(qū)白質(zhì)受累為著，逐漸波及全部大腦白質(zhì)。小腦白質(zhì)也可出現(xiàn)異常信號(hào)，但通常不發(fā)生液化。本組12例VWM患兒均具有上述典型頭顱MRI特征。

VWM是第1個(gè)被確定的因mRNA翻譯啟動(dòng)異常所導(dǎo)致的人類(lèi)遺傳疾病，其致病基因在2001至2002年被確定是由elF2B的5個(gè)亞單位(elF2Bα、β、γ、δ、ε)的相應(yīng)編碼基因EIF2B1～5的任一基因突變引起。臨床診斷為VWM的患者95%存在EIF2B1～5基因突變。目前關(guān)于VWM的研究對(duì)象多為白種人，65%的VWM患者為EIF2B5基因突變所致。EIF2B5基因的錯(cuò)義突變R113H被認(rèn)為是一熱點(diǎn)突變，可能發(fā)生于近40%的VWM患者中[5,7～9]。在所有已發(fā)現(xiàn)的EIF2B1～5突變中，以錯(cuò)義突變?yōu)橹?，無(wú)義突變很少[6]。目前確診的VWM患者中，攜無(wú)義突變患者多為無(wú)義加錯(cuò)義的復(fù)合雜合子，而非純合無(wú)義突變，提示該基因功能非常重要，攜無(wú)義突變純合子患者可能不能存活[2]。目前尚無(wú)確定的基因型-表型相關(guān)性。在本組VWM患兒中，EIF2B突變譜與既往報(bào)道存在差異，在16種突變中9種為既往未報(bào)道的新突變。突變僅發(fā)生在EIF2B5，EIF2B3和EIF2B2上，其中EIF2B5突變占68.8%(11/16)；EIF2B3突變占18.8%(3/16)，高于國(guó)外報(bào)道的7%[5，6]。5/12例患兒攜帶EIF2B3突變。提示中國(guó)VWM患兒EIF2B3突變率可能較高。本研究還發(fā)現(xiàn)了EIF2B3的一個(gè)熱點(diǎn)突變p.I346T，5例攜帶EIF2B3突變的患兒中，有4例攜帶此突變。既往報(bào)道的EIF2B5熱點(diǎn)突變p.R113H在本組VWM患兒中未被發(fā)現(xiàn)。因此初步推測(cè)中國(guó) VWM患兒可能具有其獨(dú)特的EIF2B基因突變譜，與VWM白種人患者的EIF2B突變譜有所不同。但基于本研究樣本量較小，尚需累積更多患兒的基因突變分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)。

elF2B突變導(dǎo)致VWM的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚[10～13]。在真核細(xì)胞蛋白翻譯啟動(dòng)時(shí)，elF2-GTP負(fù)責(zé)將Met-tRNA結(jié)合至40S核糖體亞單位上，識(shí)別并結(jié)合mRNA上相應(yīng)的起始密碼AUG從而啟動(dòng)翻譯過(guò)程，隨即 elF2-GTP脫磷酸為eIF2-GDP而失去活性。elF2B具有GEF活性，負(fù)責(zé)eIF2的GDP/GTP轉(zhuǎn)化，使elF2-GDP再次轉(zhuǎn)化為具有活性的elF2-GTP，投入下一輪蛋白質(zhì)翻譯啟動(dòng)過(guò)程[14]。eIF2Bε是最重要的eIF2B亞單位，由721個(gè)氨基酸組成，其C末端的第518～712位氨基酸殘基與底物eIF2結(jié)合，發(fā)揮其GEF活性。N末端500個(gè)氨基酸是與其他亞基結(jié)合的作用區(qū)域，可能影響亞單位之間的結(jié)合[14]。eIF2Bε突變可能通過(guò)不同途徑影響蛋白功能從而致病，包括影響蛋白表達(dá)量、五聚體形成、eIF2B與底物結(jié)合等多種途徑。本研究初步結(jié)果顯示，p.R296X和 p.S610-D613del突變導(dǎo)致eIF2Bε蛋白表達(dá)量顯著下降，因此不能生成足夠具有功能的eIF2B復(fù)合體，為嚴(yán)重影響功能的突變。p.R296X和 p.S610-D613del突變均發(fā)生在復(fù)合雜合子中，推測(cè)如為突變純合體，因嚴(yán)重缺乏有功能的eIF2Bε蛋白，患兒可能無(wú)法存活。

本研究首次對(duì)中國(guó)VWM患兒進(jìn)行了eIF2B各亞單位的基因突變篩查，并發(fā)現(xiàn)了國(guó)際上未報(bào)道的9種新突變，且初步揭示中國(guó) VWM患兒可能具有與白種人群不同的基因突變譜。目前初步的功能研究結(jié)果提示，eIF2Bε的兩種新突變p.R296X及 p.S610-D613del可導(dǎo)致蛋白表達(dá)量顯著下降，提示其嚴(yán)重影響eIF2Bε蛋白功能。為進(jìn)一步探討VWM基因型和表型的關(guān)系以及VWM的發(fā)病機(jī)制，本課題組正在繼續(xù)收集病例，并進(jìn)行下一步的突變功能研究。

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