龔艷清 鄭洋妹 陳信忠

(1.廈門出入境檢驗檢疫局 福建廈門 361026;2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院)

1 前言

異尖線蟲屬于蛔目 (Ascaridida)異尖科 (Anisakidae),主要包括 4個屬的線蟲:即異尖線蟲屬(Anisakis)、偽地新線蟲屬 (Pseudoterranova)、對盲囊線蟲屬 (Contracaecum)和宮脂線蟲屬 (Hysterothylacium)。簡單異尖線蟲是我國海魚異尖線蟲寄生的優(yōu)勢種,孫世正[1]的調(diào)查顯示南海和渤海魚類簡單異尖線蟲的感染都相當高,其中南海 88個魚種中檢出率為 60.2%,渤海 20個魚種中檢出率為 55%;馬宏偉等[2]對渤海魚類異尖科線蟲幼蟲感染的專項調(diào)查顯示簡單異尖線蟲幼蟲的檢出率為 63.4%;張莉[3]對渤海魚類感染簡單異尖線蟲的調(diào)查顯示其幼蟲的檢出率為 53.1%。

目前對異尖線蟲幼蟲的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)觀察和血清免疫學(xué)方法。由于異尖線蟲種類多,寄生于人體和魚類的幼蟲蟲體細小,很多種間形態(tài)差異不明顯,因此,依據(jù)傳統(tǒng)的解剖形態(tài)學(xué)觀察很難鑒別蟲種。血清學(xué)方法包括皮內(nèi)試驗、間接血凝試驗、熒光抗體試驗以及酶聯(lián)免疫吸附試驗 (EL ISA)等。異尖線蟲病與其他寄生蟲病一樣,抗原的提純很難且易變性失活,相近種間的交叉反應(yīng)很難消除,特異性和敏感性較差,因此免疫學(xué)方法還需要進一步的研究。近年來國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用 PCR方法對多種異尖線蟲幼蟲進行檢測和鑒定,取得良好效果,但電泳時所用的核酸染料溴化乙錠 (EB)是強致癌性物質(zhì),對人體健康有很大的危害。SYBR Green I是一種結(jié)合于雙鏈 DNA小溝中的結(jié)合染料,與雙鏈 DNA結(jié)合后,其熒光大大增強,且其熒光強度的增加與雙鏈 DNA的數(shù)量成正比。利用該特點建立的 SYBR Green I實時熒光定量 PCR技術(shù)已成為動物病原檢測的重要方法,它成本低,不需設(shè)計探針,具有操作簡便、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點,目前已用于細菌[4]、病毒[5]、寄生蟲[6]的檢測,但未見用該方法檢測異尖線蟲的報道。本文應(yīng)用 SYBR Green I實時熒光定量 PCR技術(shù),對我國沿海海魚中常見的簡單異尖線蟲幼蟲進行研究并建立了快速鑒定方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 蟲體來源

簡單異尖線蟲 (A.sim plex s.str)及其 ITS重組質(zhì)粒 (AS-ITS-pG M)、典型異尖線蟲 (A.typica)、針蛔線蟲 (R.trichiuri)、對盲囊線蟲 (Contracaccum sp.)由本實驗室保存。

2.1.2 主要試劑和儀器

總 DNA抽提試劑盒:購自上海 Sangon生物工程有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP:購自 Promega公司;SYBR Green I PCR反應(yīng)混合液:ROCHE公司產(chǎn)品;引物:由上海生物工程有限公司合成;熒光定量 PCR儀 7300型:美國 AB I公司。

2.1.3 引物設(shè)計和合成

根據(jù)簡單異尖線蟲 ITS-2保守序列設(shè)計特異性引物,AS-F:5,-GAG GGT CGA ATT ACG GTG AA-3,;AS-R:5’-AAC CGC TCG TCA TAT TGT CC -3,,預(yù)計擴增簡單異尖線蟲片段為114bp。

2.2 方法

2.2.1 線蟲總 DNA的提取

取保存在 75%酒精中的單條蟲體用蒸餾水反復(fù)沖洗后,研碎,DNA提取按 DNA抽提試劑盒說明操作。

2.2.2 普通 PCR

采用 50μL反應(yīng)體系。在 PCR反應(yīng)管中加入DNA模板 5μL、10×Tag酶緩沖液 5μL、25 mmol/L MgCl2 5μL、2.5mmol/L dNTP 4μL、20μmol/L 引物AS-F/AS-R各 1μL,5U Tag酶 0.5μL,加 DEPC處理水至 50μL。低速離心,使混合物集中在反應(yīng)管的底部,然后將反應(yīng)管置于 PCR擴增儀中。擴增條件為:先 95℃預(yù)變性 5 min,然后 95℃變性 30 s、56℃退火 30 s、72℃延伸 30s,擴增 30個循環(huán) ,最后72℃ 10 min,4℃保存。

2.2.3 序列的分析與比較

將 PCR產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進行測序,并根據(jù) Genbank/NCB I數(shù)據(jù)庫,用 BLAST軟件對擴增出的異尖線蟲的基因序列與基因庫相應(yīng)的基因序列進行同源性比較。

2.2.4 SYBR Green I PCR檢測

采用 20μL反應(yīng)體系。在 PCR反應(yīng)管中加入DNA模板 2μL、SYBR Green I PCR反應(yīng)混合液10μL,引物 AS-F/AS-R各 0.3μL,加滅菌雙蒸水至 20μL。低速離心,使混合物集中在反應(yīng)管的底部,然后將反應(yīng)管置于熒光定量 PCR儀中。反應(yīng)條件為:先 50℃ 2 min,95℃ 10 min;然后 95℃ 15 s,60℃1 min,40個循環(huán)。為了分析 SYBR Green I PCR擴增特異性,應(yīng)對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析 ,條件為 :95℃15 s,60℃30 s,95℃15 s。

2.2.5 引物濃度的優(yōu)化

將合成的引物稀釋成 20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L和 1μmol/L 4個稀釋度 ,然后按 2.2.4的方法進行 SYBR Green I PCR反應(yīng)。

2.2.6 靈敏度試驗及標準曲線的建立

以 10倍倍比稀釋后的AS-ITS-pG M為模板,按 2.2.4的方法分別進行實時熒光定量測定,再利用隨機軟件進行分析,建立標準曲線。

2.2.7 SYBR Green I實時熒光定量 PCR特異性試驗

用建立起來的 SYBR Green I實時熒光定量PCR對典型異尖線蟲、針蛔線蟲、對盲囊線蟲和簡單異尖線蟲進行擴增,同時設(shè)立陰性對照,觀察該反應(yīng)的特異性。雖異尖線蟲還包括 A.physeteris,A.ziphidarum等 7個種,但在臺灣海峽的水產(chǎn)品中筆者只檢測和收集到了典型異尖線蟲、針蛔線蟲、對盲囊線蟲和簡單異尖線蟲這 4個種。

2.2.8 重復(fù)性與穩(wěn)定性檢測

為驗證熒光定量 PCR檢測結(jié)果的重復(fù)性與穩(wěn)定性,對陽性標準品進行重復(fù)試驗。

2.2.9 樣品鑒定

取 7份經(jīng) PCR-RFLP鑒定為簡單異尖線蟲的樣品,用本研究建立的 SYBR Green I PCR法進行鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 普通 PCR結(jié)果

如圖 1所示,用AS-F/AS-R引物擴增簡單異尖線蟲核酸,電泳后在 114bp處有一條明亮的條帶,與預(yù)計大小一致。

圖 1 普通 PCR電泳結(jié)果

3.2 擴增產(chǎn)物序列比較

所測序列與基因庫中所列的 Anisakis simplex DNA序列均有 99%以上的同源性。

3.3 SYBR Green I實時熒光定量 PCR引物濃度的優(yōu)化結(jié)果

從圖 2分析,簡單異尖線蟲的引物濃度為20μmol/L時,Ct值均較小,熒光閾值高,擴增曲線較為理想,因此將 20μmol/L引物濃度選擇為最佳工作濃度。

圖 2 引物濃度優(yōu)化

3.4 靈敏度試驗和標準曲線

3.4.1 靈敏度試驗

由圖 3可知,簡單異尖線蟲 SYBR Green I實時熒光定量 PCR最低檢出量為 101拷貝 /μL的陽性模板。

圖 3 靈敏性試驗結(jié)果

3.4.2 標準曲線

以稀釋后的標準品為模板進行定量 PCR反應(yīng),簡單異尖線蟲在 106拷貝 /μL～102拷貝 /μL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系,濃度過高或過低都會對曲線的形成造成誤差。從電腦自動生成的簡單異尖線蟲的 SYBR Green I PCR標準曲線 (見圖 4)可知,其斜率為 -3.521,截距為 5.596,相關(guān)系數(shù) R2=0.999,從而得出模板濃度 (x)與循環(huán)閾值 (Ct)之間的線性關(guān)系曲線公式為:Ct=-3.521 lgx+5.596;從儀器讀取待測樣品的 Ct值,代入公式就可以計算出其初始濃度。

圖 4 熒光定量 PCR標準曲線

3.5 熔解曲線分析

熔解曲線峰值的一致性,檢測產(chǎn)物的特異度,是結(jié)果是否準確可信的重要參考指標。從圖 5的熔解曲線圖可以看出,各樣本的峰值基本一致,簡單異尖線蟲的均為 76.8℃左右,未見雜峰信號出現(xiàn),說明 PCR參數(shù)選擇適當,產(chǎn)物特異性較好,非特異產(chǎn)物對結(jié)果影響較小,從而為定量打下基礎(chǔ)。

圖 5 PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線

3.6 實時熒光定量 PCR重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗

以稀釋后的 AS-ITS-pG M,20μL體系在同樣反應(yīng)條件下每個稀釋度連續(xù) 3次進行 SYBR Green I熒光 PCR,結(jié)果見圖 6。圖 6顯示每次檢測之間的誤差不到 1個循環(huán),擴增效率穩(wěn)定,說明本試驗建立的簡單異尖線蟲 SYBR Green I PCR方法具有較高的可重復(fù)性,可保證不同樣品間檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

圖 6 重復(fù)性試驗結(jié)果

3.7 特異性試驗結(jié)果

從圖 7可以看出,用 SYBR Green I PCR鑒定簡單異尖線蟲的特異性,結(jié)果只與簡單異尖線蟲反應(yīng),與典型異尖線蟲、針蛔線蟲、對盲囊線蟲無交叉反應(yīng),空白對照孔無熒光響應(yīng),表明本方法具有良好的檢測特異性。

圖 7 特異性試驗擴增曲線圖

3.8 樣品鑒定

對 7份從不同魚種經(jīng) PCR-RFLP鑒定為簡單異尖線蟲的樣品進行鑒定,陽性對照為 106拷貝/μL的簡單異尖線蟲陽性標準品,陰性對照為雞的肌肉組織核酸提取物。結(jié)果 (見圖 8)顯示樣品 1～7均為陽性,與 PCR-RFLP檢測結(jié)果一致。

圖 8 簡單異尖線蟲樣品鑒定結(jié)果

4 討論

由于異尖線蟲病在全球已呈擴散趨勢,且簡單異尖線蟲為我國常見異尖線蟲的優(yōu)勢種,因此,建立一種快速鑒別鑒定方法非常必要。本研究選取簡單異尖線蟲保守的 ITS-2序列設(shè)計一對引物,建立的簡單異尖線蟲 SYBR Green I實時熒光定量PCR快速鑒定方法能夠用于簡單異尖線蟲的鑒別檢測,并且與常規(guī) PCR方法相比,具有操作簡便、質(zhì)量控制好、特異性更高、定量更準確、重復(fù)性更好;無需 PCR后處理,反應(yīng)全程閉管操作,大大降低了交叉污染的危險性等優(yōu)點。此方法對于簡單異尖線蟲的監(jiān)控檢測有著重要的實用價值,適于實驗室對大量樣品的檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查以及分子生物學(xué)等方面的研究。

[1] 孫世正.南海、渤海魚類簡單異尖線蟲幼蟲感染的調(diào)查[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,1996,14(3):173～176.

[2] 馬宏偉,姜泰京,全福實,等.渤海魚類和頭足類異尖科線蟲幼蟲感染情況調(diào)查[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報,2001,24(2):105～114.

[3] 張莉.渤海魚類簡單異尖線蟲幼蟲感染的初步調(diào)查[J].滄州師范專科學(xué)校學(xué)報,2002,18(3):41～47.

[4] 任月,袁杰利,盧行安,等.糞便中腸球菌 SYBR GreenI熒光定量 PCR檢測方法的建立[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2007,19(6):499～501.

[5] 李明鳳,魏戰(zhàn)勇,王學(xué)斌,等.豬細小病毒 SYBR Green I實時定量 PCR檢測方法的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2009,21(3):220～224.

[6] 李安平,黃克和,王權(quán),等.微小隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲SYBR Green real time PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2009,39(06):510～515.