劉麗梅,趙紅衛(wèi),傅春蓉,黃 亮,狄?jiàn)檴?方為茂

(四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,四川成都 610064)

以微生物為載體富集人體及動(dòng)物所必需的微量元素以求有機(jī)形態(tài)、制造成本較低廉而富有多種營(yíng)養(yǎng)的微量元素產(chǎn)品越來(lái)越引起人們的關(guān)注。研究表明,許多光合細(xì)菌具有一定的耐硒和富硒能力,如深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudom onas palustris)等[1-4]。其中沼澤紅假單胞菌具有富集多種微量元素的能力,是發(fā)酵工業(yè)中比較常用的菌種之一,又是優(yōu)質(zhì)的光合細(xì)菌飼料添加劑,是目前作為微量元素載體可能性比較大的菌種。沼澤紅假單胞菌本身營(yíng)養(yǎng)豐富含有多種活性成分,并且是唯一由國(guó)家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)作為飼料添加劑使用的光合細(xì)菌。研究表明,沼澤紅假單胞菌具有較高的蛋白質(zhì)含量,是一種高效優(yōu)質(zhì)的蛋白源[5]。同時(shí),沼澤紅假單胞菌中氨基酸種類齊全且消化率高,必需氨基酸總含量達(dá)40.92%,必需氨基酸與總氨基酸的比值為44.30%。另外,沼澤紅假單胞菌富含B族維生素及類胡蘿卜素,同時(shí)還含有多種免疫因子和促生長(zhǎng)因子,均有利于個(gè)體生長(zhǎng),增強(qiáng)抗病性[6]。因此,從營(yíng)養(yǎng)角度可以認(rèn)為沼澤紅假單胞菌是一種十分優(yōu)質(zhì)的飼料營(yíng)養(yǎng)源。研究表明,沼澤紅假單胞菌具有較高的富硒能力并能將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。細(xì)胞硒含量的高低是菌體富硒能力的基本指標(biāo),但硒含量與沼澤紅假單胞菌的生物量是一對(duì)相互聯(lián)系和制約的因素,單純追求高硒含量意義不大[7]。從原料利用與轉(zhuǎn)化上來(lái)看,如何提高菌體濃度及硒的轉(zhuǎn)化率,對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)更具有實(shí)際指導(dǎo)意義。從促進(jìn)沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)及對(duì)硒的富集效率來(lái)看,硒的添加方式、培養(yǎng)基初始pH、裝液量等因素[8],均對(duì)其有重要影響,通過(guò)對(duì)這些條件的優(yōu)化可以有效地提高富硒菌體的生物量及富硒效率。本文采用單一變量法,對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌富硒發(fā)酵條件進(jìn)行研究,為其以后工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平,分析天平,酸度計(jì),紫外分光光度計(jì),無(wú)菌操作臺(tái),臺(tái)式高速離心機(jī),恒溫鼓風(fēng)干燥箱,數(shù)顯恒溫水浴鍋,聚四氟乙烯消化罐(50 mL),自制光照培養(yǎng)箱。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 ①菌種：沼澤紅假單胞菌BL菌株(由前期實(shí)驗(yàn)馴化篩選后所得的具有較強(qiáng)耐硒能力及富硒能力的沼澤紅假單胞菌菌株);②發(fā)酵培養(yǎng)基：NaHCO32.0 g,CH3COONa 2.0 g,NH4Cl 1.0 g,K2HPO40.5 g,NaCl 2.0 g,MgCl20.2 g,酵母膏0.5 g,玉米漿0.8 g,添加亞硒酸鈉至所需濃度,定容至1 L。121℃下高壓蒸汽滅菌20 min,并用H3PO4調(diào)節(jié)pH至7.0;③硒標(biāo)準(zhǔn)溶液：溶解分析純亞硒酸鈉2.190 g于蒸餾水中,小心轉(zhuǎn)入1 000 mL棕色容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,取上述溶液1.0 mL,加蒸餾水稀釋1 000 mL,此溶液每毫升含硒1μg;④4%NaF溶液：稱取分析純NaF 4.1 g溶于少量蒸餾水中,定容至100 mL;⑤0.1 mol/L EDTA-Na2溶液：稱取分析純EDTA-Na23.722 g溶于少量蒸餾水中,定容至100 mL;⑥0.2%鄰苯二胺溶液：稱取分析純鄰苯二胺0.1 g,溶解于少量蒸餾水中,定容至50 mL棕色容量瓶?jī)?nèi),用前現(xiàn)配;⑦氫氧化鈉、乙醇、亞硒酸鈉、鹽酸、液體石蠟等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 光照恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件為30℃,1 500～2 000 lux光強(qiáng)度下光照培養(yǎng)7 d,接種量為5%,250 mL錐形瓶裝液量為200 mL,8層紗布牛皮紙封口,液面鋪1層無(wú)菌液體石蠟隔絕氧氣,培養(yǎng)基初始pH調(diào)為7。

1.2.2 分析方法 ①細(xì)胞濃度測(cè)試方法：比濁法測(cè)定菌液濃度,使用752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)以蒸餾水為參比測(cè)定菌液的OD660值;②富硒菌體中總硒含量的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取1.00 mL定容后的消解菌液于50 mL錐形瓶中,加水至35.00 mL,加入0.2 mL 4%NaF溶液,2 mL 0.1 mol/L EDTANa2,以掩蔽消除Ti4+、Fe3+干擾[6-7],3 mL硒試劑,用1 mol/L HCl調(diào)pH至2.0,45℃下反應(yīng)50 min,轉(zhuǎn)入125 mL分液漏斗中,加入10 mL甲苯萃取,震蕩3 min,靜置分層,棄去下面水層,將甲苯部分轉(zhuǎn)移至1 cm石英比色皿中,于334 nm下測(cè)定吸光度(Ax),由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)濃度(Cx),按下式計(jì)算樣品中的硒含量(X)。處理樣品的同時(shí),用為富硒菌體作為空白樣對(duì)照。

式中：Cx為硒標(biāo)準(zhǔn)曲線查得硒濃度(μg/mL);m為樣品的質(zhì)量(g);③富硒菌體中無(wú)機(jī)硒硒含量的測(cè)定：準(zhǔn)確取0.100 0 g富硒沼澤紅假單胞菌樣品于50 mL蒸餾水中,小火微沸30 min,抽濾得到濾液,定容至50 mL,然后按總硒含量的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,即可得樣品中的無(wú)機(jī)硒的含量;④發(fā)酵培養(yǎng)液中殘留無(wú)機(jī)硒含量的測(cè)定：取適量樣品菌液,無(wú)菌操作臺(tái)上用移液槍量取上清液1 mL加水至35 mL,以下同標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定;⑤有機(jī)硒含量的測(cè)定：有機(jī)硒含量=總硒含量-無(wú)機(jī)硒含量;⑥富硒能力(有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率)：有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率/%=(有機(jī)硒含量/總硒含量)×100%。

1.2.3 富硒沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定通過(guò)測(cè)定耐硒菌生長(zhǎng)曲線,確定最佳加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間。從斜面上挑取已馴化菌株制成菌懸液,活化12 h后,按照5%的接種量接種于液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,在恒溫光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)每隔24 h于凈化操作臺(tái)上取樣測(cè)定660 nm處菌液的吸光度。因?yàn)槲舛扰c細(xì)胞密度成線性相關(guān),由此可確定耐硒菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 富硒發(fā)酵條件的優(yōu)化 ①溫度與沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)量及富硒的關(guān)系：配制硒含量100 μg/mL的液體培養(yǎng)基,以5%接種量接種,分別在17、25、30、35、40℃的溫度下培養(yǎng)7 d,測(cè)定富硒沼澤紅假單胞菌生物量及富硒量,分析溫度對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌生物量和含硒量的影響;②培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)及富硒的影響：做發(fā)酵培養(yǎng)基中初始pH的單因素實(shí)驗(yàn),配制液體培養(yǎng)基,分別調(diào)pH為5、6、7、8、9,記為1#～5#,培養(yǎng)基中硒含量100μg/mL,以5%接種量接種,光照恒溫培養(yǎng)7 d,每隔24 h檢測(cè)菌體生物量及發(fā)酵液殘留硒含量,分析培養(yǎng)基初始pH對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌生物量與富硒過(guò)程的影響;③裝液量對(duì)于菌株生長(zhǎng)及富硒的影響：250 mL的錐形瓶中,分別加入100、150、200、250 mL液體培養(yǎng)基,接種后恒溫光照培養(yǎng)7 d,記錄樣品生物量以及菌液中硒濃度,分析裝液量對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌生物量和含硒量的影響;④硒的添加方式對(duì)菌株富硒情況的影響：在富硒發(fā)酵過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的添加硒方式對(duì)沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)具有不同的影響,硒的添加方式主要有兩種：一種是一次性加入;另一種是梯度添加法,也就是在發(fā)酵初期菌體生長(zhǎng)緩慢階段,培養(yǎng)基中硒濃度保持在較低水平,隨著菌體生長(zhǎng)繁殖加快,在菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期之前,培養(yǎng)基中硒濃度逐步提高至實(shí)驗(yàn)確定的水平。

表1 培養(yǎng)基中硒添加方式Table 1 Different add methods of Se in the medium

培養(yǎng)基初始pH為7.0,裝液量200 mL/250 mL三角瓶,接種量按照5%進(jìn)行接種,光照恒溫培養(yǎng)7 d,按照表1中的方式進(jìn)行硒脅迫處理,分別記為1#～8#,最終菌液中總硒濃度達(dá)到100 μg/mL,每天測(cè)定菌液生物量。

1.2.5 富硒沼澤紅假單胞菌富硒量的測(cè)定 根據(jù)得到的優(yōu)化條件對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌進(jìn)行培養(yǎng),按照1.2.2方法測(cè)定菌體總硒含量和菌體內(nèi)無(wú)機(jī)硒含量,測(cè)定培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)硒殘留量并計(jì)算有機(jī)硒量和硒轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果及分析

2.1 富硒沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)曲線

測(cè)定富硒沼澤紅假單胞菌,可以根據(jù)其生長(zhǎng)周期初步確定加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間。富硒沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)曲線如圖1所示。

圖1 富硒沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Se-enriched Rhodopseudomonas palustris

結(jié)果表明,富硒菌體生長(zhǎng)基本無(wú)延遲,這是因?yàn)轳Z化后的菌株對(duì)硒有了很好的耐受性,因此在低硒濃度的培養(yǎng)基中能較快的適應(yīng)環(huán)境,生長(zhǎng)加快。沼澤紅假單胞菌在第2天進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,5～7 d處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期。由于對(duì)數(shù)期菌體代謝旺盛,硒轉(zhuǎn)化量大,而衰亡期菌體會(huì)大量自溶,轉(zhuǎn)化率低,而且早期加硒對(duì)菌株的代謝活動(dòng)抑制較強(qiáng),不利于高效率富硒,從轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)周期考慮,如果是一次性加硒,第5天、第6天加硒比較好。

2.2 富硒發(fā)酵條件的篩選

2.2.1 溫度與菌株生長(zhǎng)及富硒的關(guān)系 微生物的生命活動(dòng)是由一系列生化反應(yīng)組成的,而這些反應(yīng)受溫度的影響十分明顯,不同微生物最適生長(zhǎng)溫度各不相同。按照1.2.4①操作,得到溫度與菌株生物量及菌液中硒含量的關(guān)系如圖2及表2所示。

圖2 溫度對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌生物量的影響Fig.2 The impact of temperature on the growth of Se-enriched strain

表2 第7天菌液中的殘留硒濃度Table 2 Residual Se-content in the medium on the 7th day

結(jié)果表明,溫度對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌的生物量和含硒量有較大的影響。從圖2可以看出硒含量以及富硒率均是先升高后降低,其中生物量和富硒率都是在30℃達(dá)到最高值,選擇30℃作為富硒沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)的最適溫度。

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)和富硒的影響 在沼澤紅假單胞菌富硒培養(yǎng)的過(guò)程中,培養(yǎng)基初始pH與培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)菌液中的pH相差較大,不同的pH會(huì)影響菌株生長(zhǎng)及富硒的過(guò)程。培養(yǎng)基初始pH與生物量和硒含量的關(guān)系如圖3和圖4所示。

結(jié)果表明,發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌和菌液中硒含量的影響是很大的,隨著pH由5到9逐漸升高,富硒沼澤紅假單胞菌的生物量先升高再降低,呈“鐘形”。而菌液中硒含量與pH呈“倒鐘”形。由此可見(jiàn),在pH為7左右時(shí),富硒沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng)與富硒效率最高,選擇pH=7作為富硒沼澤紅假單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH。

圖3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌生物量的影響Fig.3 The impact of initial medium pH on the growth of Se-enriched strain

圖4 培養(yǎng)基初始pH對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌富硒的影響Fig.4 The impact of initial medium pH on the Se enriching of strain BL

2.2.3 裝液量對(duì)于菌株生長(zhǎng)及富硒的影響

圖5 裝液量對(duì)沼澤紅假單胞菌生物量的影響Fig.5 The impact of culture volume on the growth of Se-enriched strain

圖6 裝液量對(duì)沼澤紅假單胞菌富硒的影響Fig.6 The impact of culture volume on the Se enriching of the strain

在沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)在同樣的生長(zhǎng)條件下,由于裝液量不同,樣品之間的生物量、富硒率之間會(huì)有一些差異。因此,設(shè)計(jì)了裝液量的實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,看三者之間是否有因果聯(lián)系。裝液量對(duì)菌株生長(zhǎng)及富硒的影響如圖5和圖6所示。結(jié)果表明,裝液量為100 mL時(shí),富硒沼澤紅假單胞菌的生物量最高,且菌液中硒濃度最低,150 mL的樣品次之,培養(yǎng)時(shí)選擇裝液量為100 mL。

2.2.4 硒的添加方式對(duì)菌株富硒情況的影響富硒沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)一般采用在第1天開(kāi)始加硒的方法,以期在長(zhǎng)時(shí)間硒脅迫中獲得高富硒量沼澤紅假單胞菌,但各實(shí)驗(yàn)所得沼澤紅假單胞菌硒含量一般,并且生物量不是很高。這是由于高濃度的硒對(duì)微生物生長(zhǎng)具有抑制作用,在富硒沼澤紅假單胞菌發(fā)酵過(guò)程中,如果一次性將硒添加到培養(yǎng)基中,通常硒的量不能過(guò)高,但是這樣會(huì)造成微生物富集到的硒含量較低[9-10]。按照1.2.4中④操作,亞硒酸鈉不同添加方式對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌生物量如表3所示。

1#、6#、8#3個(gè)樣品是一次性將菌液中硒濃度增加到100μg/mL,三者比較,1#、6#生物量相差不大,8#生物量高于前兩者,說(shuō)明在富硒沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)初期加入高濃度亞硒酸鈉,會(huì)抑制沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng)。但是當(dāng)經(jīng)過(guò)馴化的沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)到一定程度時(shí),加入高濃度的亞硒酸鈉并未對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生非常強(qiáng)的影響,證明經(jīng)過(guò)馴化培養(yǎng)的菌株對(duì)亞硒酸鈉有著很強(qiáng)的抗性;2#與3#相比,2#第1天培養(yǎng)基中硒濃度被加至20 μg/mL,3#第2天濃度被加至30μg/mL,后面幾天3#生長(zhǎng)比2#要理想,可能是因?yàn)?#加入的亞硒酸鈉抑制菌株生長(zhǎng),而3#經(jīng)過(guò)多1 d的生長(zhǎng),進(jìn)入對(duì)數(shù)期后迅速生長(zhǎng),故生物量比2#大;4#、5#處于富硒沼澤紅假單胞菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而且每次加入的硒濃度只有30μg/mL,不會(huì)對(duì)沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用,所以在所有的樣品中,3#與4#的生物量是最高的;7#雖然也是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加硒,但是由于一次加硒量過(guò)高,達(dá)到每次加硒濃度為50μg/mL,對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。

表3 不同硒添加方式樣品的生物量Table 3 The impact of different add methods of Se in the medium on the growth of the strain

可以看出,一次添加方式富硒沼澤紅假單胞菌的生物量相對(duì)較小,是因?yàn)閬單徕c是一次性加入,起始的環(huán)境硒濃度較高,對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)的抑制作用相對(duì)較強(qiáng),不利于沼澤紅假單胞菌進(jìn)行分裂生殖,進(jìn)而影響總生物量。梯度添加方式則是根據(jù)沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)的不同階段,采用硒濃度梯度增加法。其起始的環(huán)境硒濃度保持在較低水平,基本上不會(huì)影響沼澤紅假單胞菌的生殖過(guò)程,故生長(zhǎng)量也較高。

梯度加硒法中,3#、4#、5#未出現(xiàn)紅硒沉淀,是因?yàn)樵谡訚杉t假單胞菌生長(zhǎng)緩慢階段處于環(huán)境硒濃度較低的水平中,對(duì)沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng)抑制作用不是很強(qiáng)。隨著沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng),雖然環(huán)境中硒濃度升高,但同時(shí)沼澤紅假單胞菌的生物量不斷增加,富硒能力也逐漸增強(qiáng),沼澤紅假單胞菌可以順利地吸收轉(zhuǎn)化環(huán)境中的無(wú)機(jī)硒,并轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。

結(jié)果表明,在沼澤紅假單胞菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期采用梯度加硒的方式,沼澤紅假單胞菌的生物量最高,硒轉(zhuǎn)化率最高。

2.2.5 最優(yōu)條件下富硒沼澤紅假單胞菌菌體內(nèi)硒含量的測(cè)定 最優(yōu)條件培養(yǎng)下,梯度加硒使培養(yǎng)液中硒濃度最終為100μg/mL,培養(yǎng)1個(gè)周期后,測(cè)定菌體內(nèi)總硒含量及無(wú)機(jī)硒含量,結(jié)果如表4所示。

表4 富硒沼澤紅假單胞菌菌體內(nèi)硒含量Table 4 Se-content in the Se-enriched Rhodopseudomonas palustris

結(jié)果表明,菌體硒轉(zhuǎn)化率為89.1%,有機(jī)硒含量為97.1%,說(shuō)明菌體具有較高的富硒能力。

3 結(jié) 論

首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的沼澤紅假單胞菌菌株進(jìn)行篩選,獲得耐硒、富硒能力強(qiáng)的菌株為出發(fā)菌株,對(duì)其進(jìn)行了選育和條件優(yōu)化,探討該菌富硒發(fā)酵的特性并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,為進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。

①優(yōu)化了富硒工藝：通過(guò)單一變量法對(duì)富硒沼澤紅假單胞菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,其中,可變因素包括培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、硒添加方式、培養(yǎng)基初始pH、裝液量、接種量等。對(duì)于沼澤紅假單胞菌富硒培養(yǎng)條件的優(yōu)化如下,培養(yǎng)溫度為30℃,環(huán)境硒濃度100μg/mL,硒添加方式應(yīng)為梯度分次添加,添加時(shí)間應(yīng)為培養(yǎng)周期的第3天、第4天左右,培養(yǎng)基初始pH為7;②富硒沼澤紅假單胞菌的富硒量：利用得到的富硒菌種,在最優(yōu)條件下培養(yǎng)7 d后,測(cè)得硒濃度下降為10.9μg/mL,硒的轉(zhuǎn)化率為89.1%,菌體富硒量可達(dá)到73.54 mg硒每克干菌種,有機(jī)硒含量為97.1%;③利用沼澤紅假單胞菌生產(chǎn)有機(jī)硒是可行的。而通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究,從提高菌體濃度及硒的轉(zhuǎn)化率的角度,為富硒菌體作為動(dòng)物飼料添加劑或者人類食用營(yíng)養(yǎng)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了指導(dǎo)意義。

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