李富祥,唐楊春,宋建領(lǐng),王金萍,張 健,李華春＊

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南昆明 650224;2.云南省野生動(dòng)物園,云南昆明 650218)

腸球菌為革蘭陽(yáng)性球菌,最初歸于鏈球菌屬,直到1984年Schleifer KH等[1]才將其從鏈球菌屬中分離出來(lái)作為一個(gè)獨(dú)立的菌屬,命名為腸球菌屬。腸球菌共包括19個(gè)種[2],糞腸球菌(E.faecalis)和屎腸球菌(E.faecium)為其代表種,從臨床標(biāo)本分離的腸球菌以糞腸球菌最為多見(jiàn),占80%～90%。腸球菌為重要的條件致病菌,可以引起人和動(dòng)物的心內(nèi)膜炎,膽囊炎,腦膜炎,尿路感染及傷口感染等多種疾病[3]。近年來(lái),在動(dòng)物醫(yī)學(xué)方面,已報(bào)道了腸球菌引起豬、羊、雞、鴨等多種動(dòng)物疫病[4-7],造成重大經(jīng)濟(jì)損失,在獸醫(yī)臨床上,由于抗生素的大量使用,尤其是第3代頭孢菌素的廣泛應(yīng)用,使腸球菌的感染率不斷上升,腸球菌引起的動(dòng)物疫病也逐漸引起了人們的關(guān)注。目前,腸球菌引起老虎等野生動(dòng)物疫病國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。本文報(bào)道了1株虎源致病性腸球菌的分離鑒定,并對(duì)該菌的生理生化、藥敏試驗(yàn)、小白鼠致病性實(shí)驗(yàn)、16S rDNA基因序列分析等生物學(xué)特性做了系統(tǒng)研究,對(duì)腸球菌感染野生動(dòng)物疫病流行病學(xué)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 來(lái)自云南野生動(dòng)物園病死老虎的肝臟和肺臟。

1.1.2 主要試劑 16S rDNA通用引物由上海生工合成;細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自上海生工;Taq酶購(gòu)自大連寶生物公司;15k DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂、細(xì)菌生化鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;兔血瓊脂平板和羊血瓊脂平板自制。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小白鼠、兔購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將病料畫(huà)線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(加入1%葡萄糖),37℃培養(yǎng)過(guò)夜,再挑典型單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、兔血瓊脂平板、羊血瓊脂平板和營(yíng)養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察 分別挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上單菌落和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物涂片,革蘭染色鏡檢,觀察本菌在固體和液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌形態(tài)差異。

1.2.3 生化鑒定和抗菌藥物敏感試驗(yàn) 將本菌純培養(yǎng)物接種于36種細(xì)菌鑒定生化管,觀察細(xì)菌的生化特性,方法按照使用說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。再將本菌純培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水稀釋后涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂,按美國(guó)臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)研究所CLSI/NCCLS 1999～2005年頒布的抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)并判定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為抑菌圈直徑在15～20 mm為高敏,10～14 mm為中敏,10 mm以下為低敏,0 mm為不敏感(耐藥)。

1.2.4 小白鼠致病性實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌LD50的測(cè)定將純培養(yǎng)細(xì)菌稀釋于滅菌生理鹽水制成菌液,用細(xì)菌平板記數(shù)法測(cè)定菌液的濃度為9×1010cfu/mL,腹腔注射4只小白鼠,0.3 mL/只鼠,并設(shè)肉湯作空白對(duì)照,記錄發(fā)病和致死情況,觀察本菌對(duì)小白鼠的致病性,剖解病死小白鼠,無(wú)菌采肺臟、肝臟做細(xì)菌分離培養(yǎng),同時(shí)觀察病理變化。在測(cè)定最小致死量和最大存活量的基礎(chǔ)上,再將純培養(yǎng)細(xì)菌原液(9×1014cfu/mL)做10-3、10-4、10-5、10-6稀釋后,每個(gè)稀釋度分別腹腔注射10只小白鼠,0.3 mL/只鼠,觀察小白鼠的發(fā)病情況,觀察14 d,記錄病死數(shù),按Reed-Muench法進(jìn)行計(jì)算細(xì)菌的半數(shù)致死量。

1.2.5 16S rDNA核苷酸序列擴(kuò)增及序列分析按試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)菌基因組DNA,作為PCR模板,按參考文獻(xiàn)[9]報(bào)道的16S rDNA引物序列合成一對(duì)引物,Pf：5′-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3′(20 bp);Pr：5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′(19 bp)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因片段,50 μL反應(yīng)體系：ddH2O 38.5μL,10×Taqreaction buffer(Mg2+plus)5μL,dNTP(2.5 mmol/L)4 μL,上下游引物各1μL,模板0.25μL,Taq0.25 μL。擴(kuò)增條件為96℃預(yù)變性3 min(94℃30 s,57℃30 s,72℃90 s)30個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank上其他糞球菌進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性

在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成直徑1 mm灰白色小菌落,菌落光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊。在麥康凱瓊脂上形成較營(yíng)養(yǎng)瓊脂小的菌落,在血瓊脂上形成較鏈球菌稍大的菌落,在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長(zhǎng),也較易形成長(zhǎng)鏈。在綿羊血平皿上不溶血,在兔血平皿上呈α溶血。

2.2 細(xì)菌染色特性

革蘭染色呈陽(yáng)性球菌,常成對(duì)、單個(gè)或鏈狀排列,少數(shù)成簇排列形似葡萄球菌,無(wú)芽胞和莢膜,液體培養(yǎng)物易形成4～12個(gè)長(zhǎng)鏈狀。

2.3 生化試驗(yàn)

本菌分解葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、纖維二糖、水楊素、膽汁七葉苷產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,PYR(吡咯垸酮芳胺酶實(shí)驗(yàn))分解試驗(yàn)陽(yáng)性,6.5%NaCl肉湯培養(yǎng)能生長(zhǎng);不分解乳糖、棉籽糖、血清菊糖、阿拉伯糖,木糖、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇、側(cè)金盞花醇;MR試驗(yàn)陽(yáng)性;氧化酶、過(guò)氧化氫酶、尿酶、H2S、VP試驗(yàn)、硝酸鹽還原、枸櫞酸鹽、精氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶陰性。

2.4 藥敏試驗(yàn)

本菌對(duì)青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、氯霉素等為敏感(S),對(duì)頭孢唑啉、頭孢噻吩為中介(I),對(duì)阿米卡星、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺甲唑、紅霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素等為耐藥(R),各藥物的抑菌圈直徑大小見(jiàn)表1。

表1 分離菌株對(duì)藥物的敏感性Table 1 Drug sensitivty test of the isolated strain

2.5 小白鼠致病性試驗(yàn)

每只小白鼠腹腔接種2.7×109cfu,在接種菌液后,4只小白鼠均在12 h出現(xiàn)精神沉郁、被毛逆立、站立不穩(wěn)、呼吸急促、黃色水瀉(此癥狀與發(fā)病老虎臨床癥狀相同)等典型臨床癥狀,48 h死亡2只,另外2只小白鼠也在3 d內(nèi)全部死亡,剖檢病死小白鼠可見(jiàn)腸內(nèi)充滿黃色漿液,肝臟重大,肺臟充血、出血。并再次從病死小白鼠肺臟和肝臟分離到相同細(xì)菌,表明該株細(xì)菌對(duì)小白鼠具有較強(qiáng)的致病性。小白鼠接種不同劑量的菌液后,12 h開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀,1 d后高劑量組小白鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡,死亡高峰集中在2～4 d,7 d后停止死亡。各劑量組小白鼠共死亡23只,總死亡率為57%,LD50為109.2cfu,分離菌株LD50計(jì)算表見(jiàn)表2。

表2 分離菌株LD50計(jì)算表(接種量為0.3 mL)Table 2 The table ofLD50calcualation(Inoculum：0.3 mL)

距離比例=(高于50%的死亡率百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%的死亡率百分?jǐn)?shù)-低于50%的死亡率百分?jǐn)?shù))=(92.8%-50%)/(92.8%-36%)=0.8

LogLD50=距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%的死亡率的稀釋度的對(duì)數(shù)=0.8×(-1)+(-4)=-4.8

LD50=10-4.8/0.3 mL,即將細(xì)菌原液(9×1014cfu/mL)稀釋104.8后接種300 mL(2.7×109.2cfu/0.3 mL)可使50%小白鼠發(fā)生死亡。

2.6 16S rDNA核苷酸序列擴(kuò)增及序列分析

圖1 分離菌株16S rDNA核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR-amplified 16S r DNA

擴(kuò)增片段大小在1 000～15 000 bp之間與預(yù)期片段1 415 bp大小相符,擴(kuò)增正確。將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank上其它糞球菌進(jìn)行同源性分析,結(jié)果表明擴(kuò)增序列與GenBank公布的致病性腸球菌(登陸號(hào)為EU285587)同源性為100%,進(jìn)一步證實(shí)該菌株為致病性腸球菌。

3 討 論

糞腸球菌長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是條件致病菌,在醫(yī)學(xué)上是第二大院內(nèi)感染疾病,已受到高度重視。但在獸醫(yī)臨床上,最近幾年才引起人們的關(guān)注,已報(bào)道了腸球菌引起豬、羊、雞、鴨等多種動(dòng)物疫病。研究表明,致病性菌株和非致病性菌株存在本質(zhì)區(qū)別,Shankar[10]提出糞腸球菌存在著毒力島基因結(jié)構(gòu)。Leavis H[11]也在屎腸球菌中發(fā)現(xiàn)一個(gè)毒力島類似結(jié)構(gòu),由7個(gè)與細(xì)菌調(diào)節(jié)、毒力和抗生素抗性有關(guān)的ORF(溶血素的基因(cyl)、表面蛋白(esp)、心內(nèi)膜炎抗原(efaA)、明膠酶(gelE)等)聚集在一起形成。腸球菌毒力島的存在與其致病性密切相關(guān),后來(lái)Coburnd PS[12]研究進(jìn)一步表明毒力島基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是強(qiáng)弱毒株的本質(zhì)區(qū)別,毒力島基因前的調(diào)控因子PerA在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用,決定著腸球菌的致病性。毒力島的發(fā)現(xiàn),使人們認(rèn)識(shí)到糞腸球菌和屎腸球菌致病性正在發(fā)生著某種變化,這也是腸球菌感染越來(lái)越受關(guān)注的原因。本菌能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小白鼠致死,其LD50為2.7×109.2cfu/0.3 mL,表明本腸球菌分離株對(duì)此小白鼠有強(qiáng)致病性,但本菌毒力島基因有待進(jìn)一步研究。

該分離菌株對(duì)青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、氯霉素等敏感(S),對(duì)頭孢唑啉、頭孢噻吩為中介(I),對(duì)阿米卡星、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺甲唑、紅霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素耐藥(R),本菌對(duì)大多數(shù)抗生素高度耐藥,與文獻(xiàn)報(bào)道的有所差異[7,13],腸球菌耐藥性的改變也與毒力島基因的改變密切相關(guān)。

云南野生物園2只老虎相繼發(fā)病,臨床表現(xiàn)為：黃色水樣腹瀉,體溫升高,呼吸困難,食欲廢絕,消瘦,用第3代頭孢和卡那霉素治療無(wú)效,1只老虎發(fā)病3 d后死亡,剖解無(wú)菌取肺臟和肝臟,接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,分離到該細(xì)菌。根據(jù)藥物敏感結(jié)果,選用敏感藥物青霉素和氨芐西林對(duì)另1只老虎進(jìn)行治療,治療4 d后老虎迅速恢復(fù)健康,取得非常滿意的治療效果。另外,在本菌的小白鼠致病性實(shí)驗(yàn)中,小白鼠接種本菌后也出現(xiàn)了與病虎相似的臨床癥狀,即黃色水樣腹瀉,體溫升高,呼吸困難,并于第2天全部死亡,進(jìn)一步證實(shí)了老虎病因是腸球菌感染,本文報(bào)道的糞腸球菌感染老虎并導(dǎo)致老虎死亡在國(guó)內(nèi)尚屬首次。

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