黃 焱 林金泉 胡 忱 吳福進(jìn)陳水花 王愷禎 徐國興，2

?

糖尿病大鼠淚糖的變化及其與血糖、尿糖相關(guān)性研究

黃 焱1林金泉1胡 忱1吳福進(jìn)1陳水花1王愷禎1徐國興1，2

1. 福建醫(yī)科大學(xué)眼科學(xué)與視光學(xué)系 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科

目的：觀察糖尿病大鼠淚糖的變化及其與血糖、尿糖相關(guān)性。 方法：SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組和鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病實驗組；在造模前、給藥72h后、造模后1周、1月、2月，分別進(jìn)行體重、淚糖、血糖、尿糖的測定；觀察兩組各個指標(biāo)造模前后的變化。結(jié)果：糖尿病大鼠淚糖、血糖、尿糖分別與正常組相比有顯著差異。淚糖和血糖的升高不存在明顯的線性關(guān)系（P＞0.05）；血糖在給藥72h后達(dá)到高水平，并一直呈高水平狀態(tài)；淚糖呈一過性高水平的狀態(tài)，回降后隨著病程的發(fā)展而呈緩慢升高的趨勢，最后穩(wěn)定在強(qiáng)陽性。淚糖在造模72h時80％達(dá)到+++，10％達(dá)到++++；在造模1周時60％降至++，只有30％處于+++以上；造模1個月時80％達(dá)到+++以上；造模2個月時100％處于++++。結(jié)論：糖尿病大鼠淚糖的變化具有顯著意義，淚糖的含量可以反映糖尿病病程的進(jìn)展?fàn)顩r；具有簡單，靈敏，高效的淚糖測量方法可以作為臨床糖尿病患者的早期篩查并指導(dǎo)治療。

淚糖 血糖 尿糖 糖尿病

糖尿病是一種常見病、多發(fā)病。臨床上通常把檢測血糖作為診斷糖尿病的重要方法之一。但血糖易受多種因素的影響，如糖尿病患者的血糖水平極不穩(wěn)定，且采集時具有創(chuàng)傷性。本研究旨在檢測糖尿病大鼠淚糖含量，明確其與血糖、尿糖的相關(guān)性，以探討早期確診糖尿病的簡單有效的方法。

1 材料

1.1 實驗動物與環(huán)境

SD大鼠30只，雄性，體重在200～250g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于室溫24～26℃，濕度52％的清潔實驗室，安靜無噪聲，自由飲水，飲食。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素（STZ）為美國Sigma公司產(chǎn)品，三諾安穩(wěn)血糖試紙購于長沙三諾公司，尿糖分析試紙條（化學(xué)分析法），新型高靈敏葡萄糖試紙（桂林中輝生物技術(shù)有限公司），風(fēng)油精，75％的酒精。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型的建立

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)標(biāo)記并取10只做正常對照組（CON）， 20只制作糖尿病（DM）模型，作為實驗組。禁食12h，腹腔注射。實驗組（DM）：STZ按1％的濃度溶解于0.1mmol/L的檸檬酸緩沖液（pH4.2～4.5），以65mg/kg進(jìn)行腹腔注射。正常對照組（CON）：以同等劑量的0.1mmol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行腹腔注射。72h后，血糖大于16.7mmol/L，尿糖呈+++以上確定為造模成功。

2.2 血糖的測量

采用葡萄糖氧化酶法，用三諾安穩(wěn)血糖儀測量?？崭共扇∥察o脈血，于四個時間段測定。

2.3 淚糖的測量

采用葡萄糖氧化酶法，利用高靈敏葡萄糖試紙測量（比色法）。用風(fēng)油精或清涼油涂少許于大鼠下眼瞼外皮膚，幾十秒后用修剪好的且彎曲的高靈敏葡萄糖試紙至于下眼瞼穹窿部10秒后取出， 30秒時觀察有無顏色反應(yīng)，判斷陰陽性；60秒時與比色卡對比，半定量的讀取數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)的讀取由三個與本實驗無關(guān)且色覺正常的人員分別讀取，取中間數(shù)據(jù)。把0～0.55mmol/L作為-， 0.55～2.80mmol/L作為+， 2.80～5.50mmol/L作為++，5.50～16.6mmol/L作為+++，＞16.6mmol/L作為++++。如圖1

圖1 高靈敏淚糖試紙比色卡

2.4 尿糖的測量

采用葡萄糖氧化酶法，用尿糖分析試紙條測量（比色法）。大鼠提尾反射產(chǎn)生的尿液收集于干凈的容器，將試紙的試墊區(qū)浸入樣本中約2秒取出，沿著容器邊緣去除殘余尿液，橫握試紙，在30～60秒鐘內(nèi)與標(biāo)簽上的比色圖譜比較。同樣由三位與實驗無關(guān)且色覺正常人員讀取數(shù)據(jù)，取中間值。

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 大鼠的整體情況

對照組大鼠體重增長速度快，體毛光澤良好，攝食、飲水、尿量均正常。模型組的體重增長極其緩慢，毛色枯黃脫落，表現(xiàn)出多飲、多食、多尿癥狀。圖1顯示體重變化趨勢。

表1 大鼠體重變化（g）

注：造模后糖尿病組和對照組相比，P＜0.01。

3.2 大鼠的血糖變化情況

正常對照組血糖始終處于正常范圍，造模組在鏈脲佐菌素（STZ）的誘導(dǎo)下血糖水平與造模前相比，血糖升高極其顯著（P=0.000＜0.01），并且穩(wěn)定在高水平狀態(tài)。

表2 各組大鼠血糖的變化（mmol/L）

注：★糖尿病組的血糖與對照組相比，P＜0.01，糖尿病組的血糖各時間點與造模前相比，P＜0.01；

3.3 大鼠的淚糖變化情況

大鼠血糖在糖尿病組中，淚糖在給藥72h后，即刻產(chǎn)生較強(qiáng)的陽性反應(yīng)且陽性率達(dá)到百分百。造模72h后出現(xiàn)淚糖的一過性高水平，80％達(dá)到+++，10％達(dá)到++++。在造模1周時60％降至++，只有30％處于+++以上；造模1個月時80％達(dá)到+++以上；造模兩個月時100％處于++++。隨著糖尿病病程的進(jìn)展，淚液含糖量整體呈上升趨勢。對照組始終呈陰性（如表3所示）。

表3 糖尿病大鼠淚糖的變化

3.4 大鼠的尿糖變化情況

糖尿病大鼠尿糖一直呈現(xiàn)強(qiáng)陽性狀態(tài)。對照組始終呈陰性，如表4所示。

表4 糖尿病組大鼠尿糖的變化情況

3.5 統(tǒng)計分析

利用等級（秩）變量間的相關(guān)分析，分別對各個時間點上的血糖和淚糖進(jìn)行相關(guān)性分析。P值均大于0.05,差異不顯著，說明淚糖的水平與血糖的水平在同一時間點上不存在明顯的相關(guān)性。

表5 糖尿病大鼠血糖和淚糖相關(guān)性分析

4 討論

4.1 糖尿病大鼠模型的建立

一次性大劑量注射鏈脲佐菌素（65mg/kg）確實可以使空腹血糖明顯升高，形成糖尿病，成模率高，是獲得穩(wěn)定、典型的糖尿病模型的一種簡單、高效的方法[1]。在預(yù)實驗過程中，發(fā)現(xiàn)造模不是簡單的按照說明進(jìn)行，環(huán)境、鼠齡、禁食時間、注射選時、注射的速度等都可以影響需要注射的劑量。在清潔實驗室內(nèi)，大鼠的生長環(huán)境良好，造模過程中，感染的機(jī)會相對少，耐受力較強(qiáng)，則需要給予的劑量偏高。禁食的時間越長，STZ對胰島β細(xì)胞破壞力越明顯，所以延長禁食時間可以降低STZ劑量。另外，很多文獻(xiàn)敘述大鼠造模一段時間會出現(xiàn)體重下降，本實驗中，按規(guī)律的喂養(yǎng)，達(dá)到自由攝食，飲水，且生長在安靜且清潔的實驗室，糖尿病組的大鼠并不出現(xiàn)體重下降，反而穩(wěn)步上升，與對照組相比，只是大大減緩了增長的速度；大鼠體重增減，主要取決于大鼠的耐受力與藥物的毒性（STZ的劑量與質(zhì)量）。

4.2 糖尿病大鼠淚液含糖量的變化

淚液是淚腺分泌的一種水樣液體（95％以上），大部分淚液來自于主淚腺，少部分來自于副淚腺；還含有瞼板腺及杯狀細(xì)胞的分泌物、角結(jié)膜的代謝物等[2]。正常情況下的淚液含糖量是極其甚微的，在正常人中為0.5～0.7μmmol/L，是來源于淚液本身的成分。

糖尿病大鼠高淚糖來源可能來源于兩種途徑：一是分泌淚液的腺體、細(xì)胞等發(fā)生異常，改變了淚液成分的比率。目前有大量關(guān)于糖尿病眼表損傷的研究一致表明糖尿病可以使淚液中的乳鐵蛋白、溶菌酶、分泌性免疫球蛋白等成分下降，相關(guān)的病理研究表明糖尿病大鼠隨時間的延長依次表現(xiàn)為淚腺細(xì)胞水腫、增生，腺泡及導(dǎo)管萎縮，纖維增生及淋巴細(xì)胞浸潤，角膜上皮、基質(zhì)層水腫，結(jié)膜杯狀細(xì)胞減少[3，4]。這些研究可以推測糖尿病大鼠淚糖的變化可能與眼表結(jié)果的異常有關(guān)。二是糖尿病大鼠所致的高血糖破壞了眼表組織的毛細(xì)血管，導(dǎo)致血管的通透性的增加，血液中的葡萄糖可以通過毛細(xì)血管壁融入淚液中。本實驗結(jié)果顯示：糖尿病大鼠，淚糖含量與造模前、對照組相比是幾十倍的升高。造模前幾天呈一過性高水平的表現(xiàn)，有所回降后隨著病程的延長，淚糖含量呈上升的趨勢，最終達(dá)到高峰并穩(wěn)定水平。二個月病程的淚糖水平與血糖相當(dāng)。淚糖水平緩慢上升的趨勢與血管通透性隨病程進(jìn)展而增高的變化是相符合的。兩個月的糖尿病病程，血管壁已經(jīng)損傷到一定程度，此時葡萄糖可以自由透過血管壁，這與在此時淚糖水平和血糖水平相當(dāng)?shù)那闆r相符合。第一種淚糖來源，可能只在初期占有小部分的成分；因為在糖尿病引起干眼癥的原因分析中，淚液的基礎(chǔ)性分泌量減少以及球結(jié)膜的杯狀細(xì)胞密度下降已得到證實，淚液的大部分成分的濃度都是減少的[5，6]。徐志剛[7]等報道糖尿病患者的淚液功能較差，是眼表疾病的易患人群，病程長者多見。表現(xiàn)為淚膜穩(wěn)定性下降，淚液分泌量下降，角膜熒光素著色，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)減少，鱗狀上皮化生。因此，晚期糖尿病大鼠淚液含糖量應(yīng)該是減少，本實驗由于沒有檢測6個月以后的淚糖，暫時無法判斷后期的變化。至于造模過程出現(xiàn)一過性的高水平淚糖，可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞在高血糖的誘導(dǎo)下引起反應(yīng)性，暫時性的通透性增高引起的。

4.3 淚液含糖量與血糖、尿糖的關(guān)系

實驗的數(shù)據(jù)顯示淚糖在2個月之前與血糖不存在明顯的線性關(guān)系，根據(jù)上面分析當(dāng)眼表的血管通透性還未達(dá)到可以讓血糖自由通過時，淚糖的水平主要取決于此時血管壁對葡萄糖的通透性。而在后期由于淚糖達(dá)到高水平，超出我們所用測量方法的閾值，不能準(zhǔn)確測量。推測當(dāng)葡萄糖可以自由通過血管壁時，淚糖與血糖存在線性關(guān)系。尿糖與淚糖的產(chǎn)生機(jī)制不同，組織器官也不同，目前尚未有研究表明兩者存在直接的聯(lián)系。

4.4 淚糖測定的臨床意義

目前臨床上通常把檢測血糖做為診斷糖尿病方法之一，但血糖易受到多種因素影響，且糖尿病患者的血糖水平極不穩(wěn)定。而淚糖測定在統(tǒng)一采集方法的前提下，影響因素較小，并且有敏感性高、無損傷、標(biāo)本來源方便、操作簡單及淚糖含量較恒定等優(yōu)點。本研究也發(fā)現(xiàn)淚糖的水平隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展，呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢，這點可以在初診的糖尿病患者中估計其病程的長短，是血糖測量無法達(dá)到的。在經(jīng)濟(jì)成本上，高靈敏葡萄糖試紙的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于血糖試紙。

[1] 金勇,朱勇,吳南翔.實驗性鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大、小鼠糖尿病動物模型研究進(jìn)展[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(3):80-82.

[2] 徐國興.眼科學(xué)基礎(chǔ)[M].北京:高等教育出版社,2005:153-156.

[3] 陳劍,黃建艷,徐錦堂,等.糖尿病大鼠淚腺、結(jié)膜及角膜組織病理學(xué)觀察[J].眼科研究. 2003，21（4）:396-398.

[4] 虎學(xué)君, 楊巧玲, 哈文靜, 等.糖尿病2型患者眼表及淚液蛋白初步分析[J]. 國際眼科雜志,2008, 8(2): 326-329.

[5] M Dogru, C Katakami,M Inoue,et al.Tear function and ocular surface changes in noninsulin-dependent diabetes mellitus[J].Ophthalmology, 2001,108（3）:586-592.

[6] Goebbels. Tear secretion and tear film function in insulin dependent diabetics[J].Br J Ophthalmol, 2000,84(1)：19-21.

[7] 徐志剛,呂淑慧,牛小霞,等.糖尿病淚液功能和眼表面變化[J].國際眼科雜志,2009,9(10):1909-1912.