寇秀穎 杜陽(yáng)吉 徐 勇

（廣東省食品工業(yè)研究所，廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510308）

·基礎(chǔ)研究·

桑葉黃酮類和多糖類化合物的提取及其降血糖作用研究

寇秀穎*杜陽(yáng)吉 徐 勇

（廣東省食品工業(yè)研究所，廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510308）

從桑葉中提取總黃酮和多糖，并測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶和豬胰液α-淀粉酶的抑制作用以評(píng)估其降血糖功能。結(jié)果表明，桑葉中提取的黃酮類和多糖類化合物對(duì)這兩種酶都有較好的抑制作用，并且總黃酮和多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶的抑制存在協(xié)同作用，兩者混合對(duì)兩種酶的抑制作用更強(qiáng)。

桑葉；黃酮；多糖；降血糖作用；協(xié)同作用

桑葉為?？粕僦参锷 orus alba L.的干燥葉。桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，桑葉性寒、味甘苦，是中醫(yī)清熱解毒之要藥。主治風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭疼，目赤暈花等癥。已有研究表明，桑葉的降血糖效果較為顯著，但是對(duì)其降血糖有效成分的確認(rèn)一直存在爭(zhēng)議，有觀點(diǎn)認(rèn)為其降血糖有效成分是黃酮類化合物或多糖類化合物，也有學(xué)者認(rèn)為是生物堿類化合物。為了更有效地開(kāi)發(fā)和利用桑葉這種天然產(chǎn)物在治療糖尿病方面的藥用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)對(duì)桑葉中黃酮類化合物和多糖類化合物的提取和純化進(jìn)行了研究，并對(duì)其降血糖功能進(jìn)行了測(cè)定。本研究為桑葉在糖尿病的臨床治療方面提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)，也將促進(jìn)桑葉在功能食品中的開(kāi)發(fā)和利用。

1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.1 原料與試劑

桑葉，廣東韶關(guān)；Diaion HP-20大孔樹(shù)脂，日本三菱公司；葡萄糖及蔗糖，AR級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠；MECK堿性氧化鋁固相萃取柱，German；各種型號(hào)的層析柱；α-葡萄糖苷酶、豬胰液α-淀粉酶以及藍(lán)淀粉，Sigma。

1.2 儀器

UV－6300PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；5415D離心機(jī)，Eppendorf公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器設(shè)備廠；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器，上海青浦滬西儀器廠。

2 桑葉多糖的提取及含量測(cè)定

2.1 桑葉多醣含量測(cè)定方法

按照參考文獻(xiàn)［6］和［7］的方法，以吸光度D（λ）為縱坐標(biāo)，糖質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：D （λ） =0.053 7ρ+0.035 6，R=0.997 9。表明在質(zhì)量濃度為1.0 mg/L～10 mg/L具有良好線性關(guān)系。

2.2桑葉多糖的提取及純化

稱取100 g桑葉粉末，按1∶30的料液質(zhì)量比加入去離子水，在80℃恒溫下回流提取3 h，重復(fù)3次。最后過(guò)濾提取液，重復(fù)10次，合并濾液后進(jìn)行濃縮精制。

將3 LDiaion HP-20大孔樹(shù)脂裝填于層析柱中，將全部提取液加水稀釋至5 L，用恒流泵緩慢上樣，流速約為0.05 mL/s，用H2O-乙醇體系洗脫（乙醇體積濃度分別為0%、10%、30%、50%、70%、100%）。收集0%～50%組分，合并，濃縮干燥，得到純化后的桑葉多糖8.36 g。其含量測(cè)定按2.1方法進(jìn)行，結(jié)果表明桑葉多糖純度為75.69 g/100 g。

將上述純化的桑葉多糖用10倍質(zhì)量的水溶解，加入多糖溶液1/5體積的氯仿和氯仿1/5體積的正丁醇，攪拌30 min，離心，棄去下層和中間層變性蛋白，上層清液用去離子水補(bǔ)足體積，如此反復(fù)5次，真空濃縮，除去有機(jī)溶劑，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀過(guò)夜，離心。收集沉淀，用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌沉淀，真空干燥得到精制的淡黃色多糖3.65 g。其含量測(cè)定按2.1方法進(jìn)行，結(jié)果表明桑葉多糖純度為90.34 g/100 g。所得多糖用于活性測(cè)定。

3 桑葉黃酮類化合物的提取及含量測(cè)定

3.1 總黃酮含量測(cè)定方法

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加體積濃度60%乙醇溶解，定容，得標(biāo)準(zhǔn)液(含無(wú)水蘆丁0.2 g/L)。分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL到25 mL容量瓶中，用體積濃度60%乙醇定容至6 mL，加入50 g/L亞硝酸鈉溶液0.75 mL，搖勻，靜置6 min；再加100 g/L硝酸鋁溶液0.75 mL，搖勻，靜置6 min；再加40 g/L氫氧化鈉溶液10 mL，用體積濃度60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min，于500 nm測(cè)溶液吸光度。以質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，吸光度D（λ）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：D（λ） =8.475 6×ρ-0.057 3，R=0.999 8。

3.2 桑葉黃酮類化合物的提取

稱取100 g桑葉粉末，用體積濃度75%乙醇回流提取3次，每次4 h，重復(fù)10次。減壓濃縮初提液得到灰黑色浸膏。用適量的水溶解浸膏，依次用二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，各部分提取液減壓濃縮干燥。

對(duì)乙酸乙酯提取物進(jìn)行硅膠柱層析，用不同體積濃度石油醚乙酸乙酯溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過(guò)TLC檢測(cè)，將70%～100%部分合并，蒸干待用。

對(duì)正丁醇部分先用大孔樹(shù)脂Diaion HP-20進(jìn)行初分，以不同體積濃度甲醇作為洗脫劑，除去正丁醇部分中水溶性的鹽分及多糖類，棄去10%～50%部分，合并70%～100%部分，蒸干待用。

將上述幾部分提取物繼續(xù)用大孔樹(shù)脂Diaion HP-20進(jìn)行純化，以不同體積濃度甲醇作為洗脫劑，合并40%～100%部分，蒸干得到10.32 g黃棕色固體，測(cè)定該部分總黃酮含純度92.42 g/100 g，所得總黃酮用于活性測(cè)定。

4 桑葉黃酮類和多糖類化合物降血糖作用研究

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑能夠使碳水化合物的消化過(guò)程延長(zhǎng)在整個(gè)小腸進(jìn)行。由于消化時(shí)間的延長(zhǎng)，單糖被腸黏膜的吸收緩慢，使餐后血糖升高的幅度降低。如果能夠抑制人體內(nèi)消化系統(tǒng)存在的碳水化合物水解酶即α-葡萄糖苷酶（麥芽糖酶與蔗糖酶）的活性，便可以抑制餐后血糖水平的上升。因此，我們通過(guò)測(cè)定桑葉黃酮類和多糖類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶（麥芽糖酶與蔗糖酶）與豬胰液α-淀粉酶的抑制作用來(lái)評(píng)價(jià)其降血糖功能。

4.1 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的測(cè)定方法

a） 準(zhǔn)確量取200 μL的蔗糖或麥芽糖溶液，200 μL pH為7的磷酸鉀緩沖液和100 μL待測(cè)物溶液制成底物溶液；

b） 向底物溶液加入400 μL α-葡萄糖苷酶溶液，充分混合；

c）將測(cè)試樣和空白樣一起放入恒溫槽于37℃下恒溫15 min；

d） 分別加入800 μL2 mol/L的TRIS-HCl緩沖液終止反應(yīng)；

e）將反應(yīng)混合物通過(guò)堿性氧化鋁小柱以除去一些酚類物質(zhì)和酸性物質(zhì)；

f）將1 mL的萃取液和4 mL的酚酶試劑充分混合，于37℃恒溫30 min；

g）于490 nm下測(cè)定測(cè)試樣和空白樣的吸光度D（λ） 值；

h） 計(jì)算其抑制率：抑制率（%）=（D（λ）空白－D空白（λ）待測(cè)物）/D（λ）空白×100。

4.2 對(duì)豬胰液α-淀粉酶抑制作用的測(cè)定方法

a） 準(zhǔn)確量取 0.5 mol/L pH為 6.9 Tris-HCl（CaCl2）緩沖液3mL于EP管中；

b） 準(zhǔn)確稱取8 mg藍(lán)淀粉，并將其懸浮在Tris-HCl（CaCl2）緩沖液中制得藍(lán)淀粉懸浮液；

c）將藍(lán)淀粉懸浮液于沸水浴恒溫5 min，然后在37℃恒溫5 min；

d） 將0.2 mL待測(cè)物溶液（空白樣用0.2 mL Tris-HCl溶液代替待測(cè)物溶液）和0.2 mL PPA溶液加入到藍(lán)淀粉溶液中，混合均勻；

e） 將測(cè)試樣和空白樣于37℃下恒溫10 min，將0.1 mL的乙酸溶液加入測(cè)試樣和空白樣終止反應(yīng)；

f）將反應(yīng)混合物離心5 min，取上清液待測(cè)；

g） 在595 nm下測(cè)定測(cè)試樣和空白樣的吸光度；

h） 計(jì)算抑制率：抑制率（%） =（D（λ）空白－D （λ）待測(cè)物）/D（λ）空白×100。

4.3 桑葉黃酮類和多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶及α-

淀粉酶抑制作用的測(cè)定

桑葉黃酮類和多糖類化合物及兩種化合物混合后對(duì)α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶抑制作用的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抑制作用測(cè)定結(jié)果

從表1可以看出，桑葉黃酮類和多糖類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶均有抑制作用，而當(dāng)二者混合后對(duì)α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶的抑制作用顯著高于黃酮類和多糖類化合物單獨(dú)作用時(shí)的抑制作用，說(shuō)明二者結(jié)合使用在降血糖方面具有協(xié)同作用。

5 結(jié)果與討論

a）本文研究了從桑葉中提取純化黃酮類和多糖類化合物的方法，并測(cè)定了其純度。

b）本文測(cè)定了桑葉中提取的黃酮類和多糖類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶的抑制作用，結(jié)果表明黃酮類和多糖類化合物對(duì)兩種酶的抑制作用很高，都可能是桑葉中降血糖的主要成分。

c）本文測(cè)定了桑葉黃酮類和多糖類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶抑制活性的協(xié)同作用。結(jié)果表明，桑葉黃酮類和多糖類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶及豬胰液α-淀粉酶的抑制作用存在明顯的協(xié)同作用，兩者混合的抑制作用更強(qiáng)。我們初步認(rèn)為桑葉的降血糖作用可能是多種有效成分共同作用的結(jié)果，但其協(xié)同作用的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

［1］中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1960.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（下冊(cè)）［M］.上海：上海人民出版社，1977.

［3］丁盈，蔣梅香，周應(yīng)軍，等.桑葉降糖活性成分研究［J］.中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2007（6）：386－389.

［4］陳福君，盧軍，張永煜.桑的藥理研究-桑葉降血糖有效組分對(duì)糖尿病動(dòng)物糖代謝的影響［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，13（1）：24-27.

［5］A SANO N，TOM IOKA E，KIZU H，et al.Sugars with nitrogen in the ring isolated from the leaves of Morus bombycis［J］.Carbohydr Res，1994，253：235-245.

［6］戈延茹，曹恒杰，張曉蘭，等.桑黃多糖的提取工藝［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，3（12）：57-60.

［7］王莉，魯建江，劉志勇.微波輔助提取紅景天多糖及含量測(cè)定的研究［J］.中國(guó)藥學(xué)刊，2002，20（2）：227-253.

［8］蔡丹昭，劉華鋼，陳洪濤.大孔吸附樹(shù)脂分離純化番石榴葉總黃酮的研究［J］.生命科學(xué)研究，2008（12）：57-60.［

9］HANSAWASDI C.，KAWABATA J.，KASAI T..α-AmylaseinhibitorfromRoselle（HibiscussabdariffaLinn）tea［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2000，64：1041-1043.

［10］MEGHRAJBHANDARI，NILUBONJONG-ANURAKKUN，GAO HONG.α-Glucosidase and α-amylase inhibitory activities ofNepalese medicinal herb Pakhanbhed（Bergenia ciliata，Haw.）［J］.Food Chemistry，2007，106：1195-1201.

Study on antidiabetic offect of flavoinds and polysacchrides from the mulberry leaves

KOUXiu-ying*DUYang-jiXUYong
（Guangdong food industryinstitute，Guangdong provincial food industrypublic laboratory，Guangzhou 510308，China）

The crude flavonoids and polysacchrides were extracted and purified from the mulberry leaves.In order to masure their antidiabetic effect，the enzyme inhibitory effect against rat intestinal α-glucosidase and porcine pancreatic α-amylase of the flavonoids and polysacchrides were studied.The result revealed the flavonoids and polysacchrides demonstrated significant enzyme inhibitory.In addition，the isolated flavonoids and polysacchrides showed synergistic inhibitory capacity to rat intestinal α-glucosidase and porcine pancreatic α-amylase， and the inhibitory effect of flavonoids and polysacchrides was improved significantly.

mulberry leaves； flavoinds； polysacchrides；antidiabetic effect；synergistic effect

*寇秀穎，女，1979年出生，2010年畢業(yè)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)專業(yè)，博士，工程師。

2010-09-16