侯耀兵　康保珊　黃進(jìn)勇

摘要：結(jié)合西瓜介紹植物中類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)、生物合成途徑中的酶及基因、合成調(diào)控研究進(jìn)展．提出目前研究存在的問題，并展望未來的研究方向。

關(guān)鍵詞：西瓜；類胡蘿卜素；基因；表達(dá)；調(diào)控

類胡蘿卜素通常是指C40的碳?xì)浠衔?胡蘿卜素)和它們的氧化衍生物(葉黃素)2類色素的總稱。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上由8個(gè)異戊二烯單位縮合而成，典型的C類胡蘿卜索攜帶紫羅酮環(huán)。環(huán)上不同位置的氫原子可被羥基、羰基、環(huán)氧基取代。在植物中．類胡蘿卜素?fù)?dān)當(dāng)葉綠體光合作用的輔助色素并保護(hù)葉綠素免受強(qiáng)光破壞。同時(shí)也是合成植物激素ABA的前體。除八氫番茄紅素和六氫番茄紅素外．絕大多數(shù)類胡蘿卜素呈黃色、橙色或紅色。約有10％的類胡蘿卜素是維生素A的前體．是人和動(dòng)物食物中重要的成分。研究表明．類胡蘿卜素在醫(yī)學(xué)保健方面有重要的作用。目前．對(duì)類胡蘿卜素的需求量很大．通過化學(xué)合成與微生物發(fā)酵等獲得的類胡蘿卜素已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)的需要。近年對(duì)其生物合成途徑的研究取得了巨大的進(jìn)展．關(guān)鍵基因先后得到分離．并初步實(shí)現(xiàn)通過基因工程來調(diào)控類胡蘿卜素的合成。

西瓜作為重要的世界性水果．在我國栽培面積近150萬hm2。西瓜有各種不同的瓤色，如黃色、橘黃色、粉紅色、紅色等，這是由于含有的類胡蘿卜素種類和量不同。瓤色是西瓜的重要性狀之一。其中類胡蘿卜素更是決定其營養(yǎng)與品質(zhì)的重要指標(biāo)。提高或改變西瓜中類胡蘿h素組成和含量．改良其品質(zhì)已成為目前西瓜育種工作的重要課題。本文概述了類胡蘿卜素生物合成途徑中的酶和基因及表達(dá)調(diào)控方面的研究。尤其是在西瓜方面的研究進(jìn)展。

1類胡蘿卜素的生物合成途徑及其相關(guān)酶的基因克隆

類胡蘿h生物合成主要是先合成前體物異戊烯焦磷酸(IPP)，LPP和其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)縮合形成檻牛兒基焦磷酸．再與2個(gè)IPP在櫳牛兒糖牛兒基焦磷酸合成酶(GGPs)催化下合成櫳牛兒糖牛兒基焦磷酸(GGPP)，GGPP是植物多種物質(zhì)生物合成的共同前體。然后2分子的GGPP由八氫番茄紅素合成酶(PSY)催化形成無色的八氫番茄紅素。后者在PDS和ZDS的作用下形成紅色的番茄紅素。番茄紅素經(jīng)LCYB和LCYE催化環(huán)化，形成2個(gè)B環(huán)的B-胡蘿卜素和a-胡蘿卜素(1個(gè)B和1個(gè)8環(huán))，這是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵分支點(diǎn)。a-胡蘿卜素通過連續(xù)的羥基化反應(yīng)形成葉黃素。B-胡蘿卜素羥基化反應(yīng)形成玉米黃素。再經(jīng)玉米黃素環(huán)氧酶催化形成堇菜黃素。

1．1IPP異構(gòu)酶

Blanc和PicherskvH首先從Clarkia Brewer中克隆了IPP異構(gòu)酶(IPPI)的eDNA。IPPI催化IPP形成DMAPP。目前在辣椒、水仙、擬南芥、萵苣等植物中得到分離鑒定．在擬南芥中發(fā)現(xiàn)2個(gè)IPPI。在大腸桿菌中．IPPI的活性受類異戊二烯合成產(chǎn)物的限制。導(dǎo)入植物、藻類或真菌IPPI eDNA都能成倍提高類胡蘿卜素含量．推測(cè)IPPI也可能是植物類胡蘿h素合成的限制因素。

1．2櫳牛兒犍牛兒基焦磷酸合成酶(GGPS)

GGPS是萜類物質(zhì)合成的一個(gè)重要分支點(diǎn)酶。該酶基因已從白羽扇豆、長春花和自芥中得到分離．其eDNA長1．1—1．4 kb，編碼316-366個(gè)氨基酸。本組從西瓜中克隆得到508bp的GGPS eDNA片段，編碼169個(gè)氨基酸序列，Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與其他植物GGPS氨基酸序列同源性在85％以上。

1．3八氫番茄紅素合成酶(PSY)

PSY是類胡蘿卜素合成途徑重要的限速酶．其基因早期是從番茄中獲得的?，F(xiàn)已從辣椒、擬南芥、玉米、黃水仙、甜瓜和白芥等植物中分離出PSY。在番茄、煙草、玉米和水稻等植物中有2個(gè)PSY基因．即PSY1與PSY2。PSYl和PSY2分別催化番茄果實(shí)和葉組織中八氫番茄紅素的合成。目前已鑒別了PSY基因家族的3個(gè)成員，PSY-A，PSY-B與PSY-C。其中PSY-A和PSY-C有很高的同源性．PSY-C和甜瓜PSY的同源性高達(dá)96％。和番茄PSYl也有非常高的同一性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明。西瓜的PSY-A和胡蘿卜PSY親緣關(guān)系近．而西瓜PSY-A和PSY-B的同源性只有54％．轉(zhuǎn)錄行為也明顯不同。目前本組已從西瓜中克隆到-748 bp的PSY eDNA片段，GenBank登錄號(hào)：(D0494214)，它編碼247個(gè)氨基酸．經(jīng)Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)．與其他植物PSY氨基酸序列同源性在90％以上．但和BANG分離得到的PSY同源性很低。

1．4八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)

PDS催化八氫番茄紅素向￡－胡蘿卜素轉(zhuǎn)化。Chamovitz等從大豆和番茄上分離到PDS。已報(bào)道從辣椒、擬南芥、玉米、黃水仙、野生煙草和白芥等植物中也分離到PDS．其eDNA長1．9～2．3 kb，編碼566-582個(gè)氨基酸。本組已經(jīng)從成熟西瓜果實(shí)中克隆得到這個(gè)基因的eDNA片段．GenBank登錄號(hào)：EFl59942。

1．5類胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISo)

Isaacson和Park等19-101分別從番茄和擬南芥中分離鑒定了類胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO)．并確認(rèn)由八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化為番茄紅素是PDS、ZDS和CRTISO 3個(gè)酶共同作用的結(jié)果．它們的催化產(chǎn)物分別是9，9－二順式－￡－胡蘿卜素、7，9，7，9"-四順式一番茄紅素和全反式番茄。在植物和藍(lán)細(xì)菌中．八氫番茄紅素是經(jīng)這3個(gè)酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)槿词椒鸭t素．而在細(xì)菌中是由單個(gè)酶(cRTI)催化。Bangt分離得到西瓜CRTISO cDNA全長，包括l 998 bp開放閱讀框。本組克隆得到484 bp的CRTISO cDNA片段(GenBank登錄號(hào)：FJ788510)，編碼161個(gè)氨基酸．經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)與其他植物CRTISO氨基酸序列同源性在80％以上。

1．6胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)

ZDS催化z－胡蘿卜素脫氫生成鏈孢霉素．繼而進(jìn)一步脫氫生成番茄紅素。目前ZDS也已從辣椒、擬南芥和黃水仙中分離出來，其eDNA長1．8-2．1 kb。編碼558-574個(gè)氨基酸。BangDt]報(bào)道了西瓜ZDS eDNA全長(2 062 bp)，包括1 758 bp開放閱讀框。ZDS和PDS基因大小相近、編碼的氨基酸同源性為29％-31％。本組從西瓜中克隆到422 bD的ZDS eDNA片段(GenBank登錄號(hào)：GQl40241)，編碼140個(gè)氨基酸，Blast比對(duì)后表明．與其他植物ZDS氨基酸序列同源性在80％以上。

2植物類胡蘿卜素合成途徑調(diào)控

2．1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控

高等植物的類胡蘿卜素的生物合成受生長和個(gè)體發(fā)育的調(diào)控。不同發(fā)育階段的花和果實(shí)所積累的類胡蘿卜素的種類及量不同。用番茄PSY、PDS、LCYB和LCYE的eDNA作探

針，檢測(cè)其果實(shí)發(fā)育過程中這些基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，在果實(shí)進(jìn)入番茄紅素積累的轉(zhuǎn)色期后．PSY基因的mRNA增加10-20倍，PDS基因的mRNA則增加近3倍．而LCYB和LCYE基因的mRNA卻明顯下降直到消失舊．番茄果實(shí)中番茄紅素積累顯然是由于轉(zhuǎn)色期后合成番茄紅素上游的PSY和PDS基因表達(dá)增強(qiáng)以及轉(zhuǎn)化番茄紅素生成胡蘿卜素的LCYB和LCYE基因表達(dá)減弱的結(jié)果。Zhu等舊用克隆到的黃花龍膽類胡蘿卜素合成基因作探針檢測(cè)花瓣發(fā)育過程中的mRNA變化，結(jié)果表明PSY、PDS、ZDS、LCYB、BCH和ZEP基因的mRNA量逐漸增加．而LCYE基因的mRNA量逐漸減少。Ban利用RT-PCR方法研究西瓜成熟果實(shí)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，PSY-A在不同瓤色西瓜中的表達(dá)沒有明顯的差異，在子房、花瓣和葉片中都有表達(dá)。PSY-B在所有瓤色西瓜中都沒有檢測(cè)到表達(dá)．在子房、葉片和根組織中卻有表達(dá)。PDS、ZDS在所有瓤色中均有表達(dá)。CRTISO除了在深黃色西瓜中沒有檢測(cè)到表達(dá)外．在其他瓤色中均有表達(dá)。研究表明，PSY-A、PSY-B、CRTISO的調(diào)控可能在轉(zhuǎn)錄水平上。發(fā)育過程對(duì)類胡蘿卜素生物合成的調(diào)控是在基因轉(zhuǎn)錄水平上。是通過調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性來控制類胡蘿卜素代謝和積累的。已證實(shí)番茄、金盞草和黃花龍膽花中類胡蘿卜素的積累也是在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控的。

2．2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

在植物類胡蘿卜素生物合成過程中．轉(zhuǎn)錄后調(diào)控也非常重要，在水仙有色體中，游離型的PSY和PDS均沒有生理活性，而與膜結(jié)合后，其生理活性便迅速被激活。Welseh等研究表明．在白芥幼苗的白化體內(nèi)．PSY以無活性狀態(tài)定位于原片層體(prolameIlarbody)上，而光照條件下，PSY與類囊體膜相結(jié)合，其活性和酶量也迅速增加。類胡蘿卜素終產(chǎn)物反饋抑制也是類胡蘿卜素合成過程中的一種調(diào)控方式．Camoisi等舊研究發(fā)現(xiàn)．向日葵中八氫番茄紅素的積累會(huì)導(dǎo)致PSY基因表達(dá)量降低。在西瓜上目前還未見轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的報(bào)道。

2．3調(diào)節(jié)基因調(diào)控

光信號(hào)傳導(dǎo)基因?qū)χ参镱惡}卜素生物合成和積累也有一定的調(diào)控作用。Liu等利用RNAi技術(shù)對(duì)光信號(hào)傳導(dǎo)基因LeHY5和LeCOPlLIKE進(jìn)行調(diào)控．LeHY5和LeCOPILIKE分別為番茄果實(shí)色素正調(diào)控和負(fù)調(diào)控因子．當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株中的LeHY5基因表達(dá)受到抑制時(shí)．葉片和未成熟果實(shí)變成淡綠色，葉綠素含量下降了24％～31％。相反．當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株中的LeCOPILIKE基因表達(dá)受到抑制時(shí)．葉片和未成熟果實(shí)變成深綠色。這一結(jié)果說明．利用RNAi技術(shù)對(duì)光信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分基因進(jìn)行調(diào)控．可以大幅度改變番茄果實(shí)的色素積累和營養(yǎng)品質(zhì)。

3展望

目前．植物類胡蘿卜素生物合成途徑中大部分的基因均已被分離和鑒定．通過類胡蘿卜素基因工程獲得“金色大米”和“金油菜”極大地增強(qiáng)人們開展其基因工程的信心。但是．對(duì)于內(nèi)源胡蘿卜素合成的相關(guān)基因在不同植物中如何表達(dá)及調(diào)控知之有限，這使得在調(diào)控植物類胡蘿卜素生物合成的基因工程研究方面因缺乏理論基礎(chǔ)而帶有盲目性。此外．通過基因工程改變類胡蘿卜素的合成途徑可能會(huì)干擾植物其他萜類化合物。如植物激素GA等的合成．影響植株的正常生長，因而更增加了植物類胡蘿卜素基因工程研究的難度。

本組克隆到多個(gè)西瓜類胡蘿卜素生物合成酶的基因．并初步分析了各基因在不同瓤色品種西瓜果實(shí)生長發(fā)育階段的表達(dá)，為下一步轉(zhuǎn)基因操作做好準(zhǔn)備。目前．克隆西瓜類胡蘿卜素代謝途徑全部酶基因．研究基因在不同品種西瓜中的表達(dá)調(diào)控以及酶活性，將對(duì)提高或改變西瓜中類胡蘿卜素組成和含量，豐富西瓜果實(shí)顏色，改良西瓜品質(zhì)都有非常重要的意義。