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維生素C陰道緩釋片微生物限度檢查法驗證研究

2009-09-18 09:50李健和彭六保等
中國當代醫(yī)藥 2009年10期

張 洪 李健和 彭六保等

[摘要]目的:建立維生素c陰道緩釋片的微生物限度檢驗方法。方法:采用平皿菌落計數(shù)法、培養(yǎng)基稀釋法、低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法進行方法驗證。結(jié)果:低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法回收率明顯高于平皿菌落計數(shù)法或培養(yǎng)基稀釋法。結(jié)論:低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法可以用于維生素C陰道緩釋片的微生物限度檢驗。

[關(guān)鍵詞]維生素c陰道緩釋片;微生物限度檢驗;方法驗證

[中圖分類號]R-331[文獻標識碼]A[文章編號]1674-4721(2009)05(b)-029-02

細菌性陰道病是正常寄生在陰道內(nèi)的菌群失調(diào)所致。近年來有研究表明:將維生素C經(jīng)陰道給藥,維持陰道內(nèi)微酸性條件對抑制雜菌生長及防止治療后復(fù)發(fā)有積極意義。德國Taurus Pharma GmBH公司將規(guī)格為250 mg的維生素C陰道緩釋片(商品名:Vagi-c1在歐洲上市,其臨床上主要用于細菌性陰道病的治療,同時可使受破壞的菌群系統(tǒng)恢復(fù)正常。據(jù)此我們立項研制開發(fā)了規(guī)格為250 mg的維生素C陰道緩釋片,以期為國內(nèi)細菌性陰道病患者提供一種安全有效的藥物。中國藥典規(guī)定含抑菌成分的藥品的微生物限度檢查,必須消除供試液抑菌活性后,再根據(jù)中國藥典規(guī)定的方法進行檢查;同時,所采用的檢測方法需進行驗證試驗,以確認供試品的抑菌活性和保證測定方法的可靠性。本文對維生素C陰道緩釋片的微生物限度檢查進行了方法驗證,為維生素C陰道緩釋片的微生物限度檢查法提供了科學(xué)依據(jù)。

1一般材料

1.1樣品

維生素C陰道緩釋片由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科和福州海王福藥制藥有限公司共同研制提供。批號為:20080226、20080227、20080228,規(guī)格為:250 mg,片。

1.2試驗茵株

大腸埃希菌fCMCC(B)441021、金黃色葡萄球菌『CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104],均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3培養(yǎng)基及稀釋劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0氯化鈉蛋白胨溶液、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,均由中國藥品生物制品檢定所提供:0.9%無菌氯化鈉溶液由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科提供。

2方法及結(jié)果

2.1細菌、霉菌及酵母茵計數(shù)方法的驗證

2.1.1菌液制備

取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物加入到適量的0.9%無菌氯化鈉溶液中,稀釋至細菌數(shù)約為每1毫升含50~100 efu的菌懸液,備用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物適量加入到適量的O.9%無菌氯化鈉溶液中,稀釋至細菌數(shù)為每1毫升含50-100 efu的菌懸液,備用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物,加適量0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子,取出霉菌孢子懸液倍量稀釋至霉菌數(shù)為每l毫升含50-100 efu的菌懸液,備用。

2.1.2供試品溶液制各

取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖溶液至100 ml,用研缽法攪勻,制成1:10均勻供試液,備用。

2.1.3試驗方法

2.1.3.1試驗組:取驗證方法項下供試液注入平皿中,加入50~100 cfu試驗菌,立即傾注45℃溶化的相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基15ml,搖勻,凝固后,按規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間,每株試驗菌平行制備2個皿,計數(shù)其菌落數(shù)。

2.1.3.2菌液組:取試驗菌液各1ml,注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個皿,按菌落計數(shù)方法測定所加的試驗菌數(shù)。

2.1.3.3供試液對照組:取驗證方法項下供試液1 ml,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,平行制備2個皿,按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

2.1.3.4稀釋劑對照組:取稀釋劑1ml替代供試品。立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,平行制備2個皿,按菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。

2.1.3.5驗證試驗:按中國藥典2005年版二部微生物限度檢查法目,進行3次獨立的平行試驗,并分別計算各次試驗菌的回收率。

2.1.3.6菌回收率的計算:稀釋劑對照組回收率=(稀釋劑對照組平均菌落數(shù)÷菌液組平均菌落數(shù))×100%;試驗組菌株回收率=[(試驗組平均菌落數(shù)一供試品對照組平均菌落數(shù))÷菌液組菌落數(shù)]x100%。

2.1.4驗證方法

2.1.4.1平皿菌落計數(shù)法:直接取1:10供試液按試驗方法注入平皿中進行方法驗證,計算其回收率,結(jié)果見表1。

2.1.4.2培養(yǎng)基稀釋法取1:10供試液l m1分別等量注入5個平皿中(0.2mD,按試驗方法進行驗證,計算其回收率,結(jié)果見表1。

2.1.4.3低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法取1:10供試液10 ml置離心管中,以500 r/min離心5 min,取上清液,作為供試液。取此供試液1 m1分別等量注入5個平皿中(0.2ml),按試驗方法進行驗證,計算其回收率,結(jié)果見表1。

2.2控制菌檢查方法的驗證

2.2.1金黃色葡萄球菌菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)18~24 h,培養(yǎng)物用O.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為10~100 cfu的菌懸液。

2.2.2銅綠假單胞菌菌液的制備

接種銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35qc培養(yǎng)18~24 h,培養(yǎng)物用O.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為10~100 cfu的菌懸液。

2.3大腸埃希菌菌液的制備

接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35℃ 培養(yǎng)18~24 h,培養(yǎng)物用O.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為10~100 cfn的菌懸液。

2.4試驗方法和結(jié)果

試驗組:取規(guī)定量供試液及10~100 cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中,依相應(yīng)的控制菌檢查方法進行檢查(《中國藥典》2005年版二部微生物檢查法金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌)。陰性菌對照組:取大腸埃希菌10~100 cfu加入增菌培養(yǎng)基中。結(jié)果:陰性對照組沒有檢出大腸埃希菌,試驗組分別檢出相應(yīng)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌,表明供試品采用《中國藥典》2005年版二部附錄ⅪJ微生物檢查法檢查對結(jié)果無明顯影響。

3樣品微生物限度檢查

按照《中國藥典》2005年版二部附錄XIJ微生物限度檢查法進行檢查。三批樣品的檢查結(jié)果見表2。檢查結(jié)果表明:三批樣品微生物限度檢查均符合規(guī)定。

4討論

維生素c分子結(jié)構(gòu)中的3一羥基,由于受共軛效應(yīng)的影響,酸性較強(pKa=4.17),微酸性條件下可抑制雜菌生長,具有抑菌作用的藥品可影響微生物限度檢查的準確性。因此,本課題研究以中國藥典2005年版二部微生物限度檢查方法驗證作為依據(jù),參考有關(guān)文獻將5種陽性對照菌的回收率試驗作為評價所采用的方法是否適合于本品種的微生物限度檢查。

回收率結(jié)果表明:維生素C陰道緩釋片對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌無抑制作用,可用常規(guī)法測定本品中的細菌數(shù)。本品用平皿菌落計數(shù)法或培養(yǎng)基稀釋法檢驗時對污染的白色念珠菌、黑曲霉都有不同程度的抑制作用,影響了菌的生長,兩種菌的試驗組回收率均低于70%,兩種方法都不能完全消除供試品的抑菌成分。當采用低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法檢驗時,由于本品中含有緩釋骨架材料,低速離心除去了這些不溶于緩沖液的骨架材料,使本品中污染的白色念珠菌、黑曲霉回收率有所提高(回收率由培養(yǎng)基稀釋法的65%提高到90%),說明骨架材料部分具有一定的抑菌活性,在實驗中采用低速離心清除了它的抑菌活性,故當選用低速離心結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法測定維生素C陰道緩釋片的細菌數(shù)時,回收率大于70%,客觀地反映了藥品污染微生物的狀況。

采用常規(guī)法檢查維生素C陰道緩釋片的控制菌。結(jié)果符合藥典規(guī)定。

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