朱濟英　吳紅衛(wèi)　王明琴　高　潁　周永坤

[摘要] 目的：探討芹菜甲素對擬老年性癡呆（AD）大鼠腦神經(jīng)元的保護機制。方法：給予D-半乳糖注射和三氯化鋁灌胃建立慢性中毒型癡呆大鼠模型；在制備AD模型同時用芹菜甲素灌胃；用Y型迷宮試驗觀察其行為學(xué)改變；用免疫組化技術(shù)檢測大鼠靜脈血液中超氧化歧化酶(T-SOD)及丙二醛(MDA)活性的變化；用熒光標記法測定腦細胞內(nèi)游離鈣離子的濃度；采用流式細胞技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)檢測神經(jīng)元細胞凋亡；并分別與對照組比較，觀察芹菜甲素對大鼠神經(jīng)元病變、學(xué)習(xí)記憶能力的影響。結(jié)果：模型組大鼠海馬和皮質(zhì)具有典型的細胞凋亡特征，T-SOD活性降低，MDA含量升高；而芹菜甲素治療組海馬和皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)減少，T-SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：芹菜甲素具有明顯抗氧化作用和抑制神經(jīng)細胞凋亡作用，其改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能可能是通過多個環(huán)節(jié)整體治療來實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 大鼠；老年性癡呆；芹菜甲素；神經(jīng)保護

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-4721（2009）05（a）-011-03

A study on the mechanism of Donepezil's protection in neuron of hippocampus in mice with Alzheimers disease

ZHU Jiying1，WU Hongwei2，WANG Mingqin1，GAO Ying3，ZHOU Yongkun4

(1.The Second Affiliated Hospital, Shandong TCM University, Jinan250001，China; 2.Jinan medical insurance manage office, Jinan250002, China; 3.Jinan medical society, Jinan250031, China; 4.The first hospital attached to Shandong traditional Chinese medical University, Jinan250011, China)

[Abstract] Objective: To study the mechanism of Donepezil's protection in neuron of hippocampus in mice with AD. Methods: The mice were given to D-galactolipin and chlorinate aluminium by intragastric administration to establishchronic Alzheimer's disease rat models, then Donepezil was given by intragastric administration. The behavioral abnormalities were investigated by Y type maze test. The expressions of T-SOD and MDA were measured by a immunohistochemistry technique. The performance and learning ability were observed. Results：Compared with model group, the performance records of learning and memory in Donepezil group were better (all P<0.01), the activity of T-SOD were decreased clearly (all P<0.05), and the expression of MDA was increased evidently (P<0.01). Conclusion: Donepezil has functions of neuroprotective effect, improvelearning and memory ability of mice with AD，it may be involved in the mechanisms of multi approaches.

[Key words] Mice;Alzheimer's disease;Donepezil;Neuroprotection

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：AD病理改變主要為tau蛋白異常磷酸化、β-淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元顆?？张輼幼冃院蜕窠?jīng)元丟失[1-2]。但病因復(fù)雜，發(fā)病環(huán)節(jié)較多，目前認為與神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、基因突變、氧化應(yīng)激和自由基損傷、鈣離子超載、免疫/炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細胞凋亡等多因素有關(guān)[3]。本實驗在建立注射D-半乳糖(D-gal)致癡呆大鼠的模型基礎(chǔ)上,再給予AlCl3連續(xù)灌胃造成擬AD復(fù)合模型,采用對照研究的方法觀察實驗動物的行為學(xué)、T-SOD、 MDA的活性、細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化及神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)和細胞凋亡的定量分析，探討神經(jīng)元凋亡在AD發(fā)病過程中的意義及芹菜甲素的防治作用機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 動物及分組清潔級雌雄各半SD大鼠80只（購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗動物中心），月齡2～3個月，質(zhì)量（280±50）g,通過行為學(xué)實驗篩選合格的大鼠隨機分為：空白對照組、模型組、腦復(fù)康組、芹菜甲素組。大鼠用標準實驗動物飼料喂養(yǎng),其中微量元素含量均可滿足動物正常生理需求。室溫（23±2）℃。

1.1.2主要儀器及試劑結(jié)晶三氯化鋁（沈陽市試劑三廠，批號：20001201)，D-半乳糖(上海試劑二廠，批號：990927。), 芹菜甲素（太原興遠生化有限公司），T-SOD、MDA試劑盒（南京建成生物工程公司，批號：20001112、20001008）；Fluostar多功能微孔分析儀(德國BMG公司)；流式細胞儀（FACS can型,美國BD公司生產(chǎn)，由濟南軍區(qū)總醫(yī)院提供）。

1.2方法

1.2.1模型制備及藥物干預(yù)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，空白對照組正常飼養(yǎng)，模型組、腦復(fù)康組及芹菜甲素組給予 D-半乳糖 50 mg/（kg·d），頸背部皮下注射，并三氯化鋁50 mg/（kg·d）灌胃，連續(xù)10周造成亞急性衰老復(fù)合模型鼠。造模的同時，芹菜甲素組按 20 mg/（kg·d）、腦復(fù)康組按200 mg/（kg·d），灌胃給予，每日1次，連續(xù)10周。

1.2.2 Y型迷宮試驗利用Y型電迷宮，參照文獻[4]方法訓(xùn)練于第10周后開始行迷宮測試，先將大鼠放入迷宮中適應(yīng)3～5 min，然后無規(guī)則次序變換安全區(qū)，訓(xùn)練大鼠對安全方位及燈光刺激的辨別能力。大鼠受電擊逃到安全區(qū)后以大鼠所在區(qū)作為下一次測試的起始位置，每日在固定時間（下午3∶00～5∶00）對每只大鼠進行15次訓(xùn)練,連續(xù)5 d。以大鼠在足底通電后10 s內(nèi)一次性跑向安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)；記錄正確次數(shù)、正確率及跑至安全區(qū)所用時間作為判定大鼠學(xué)習(xí)記憶的標準。

1.2.3測試后處理于迷宮測試完成后末次給藥后12 h，經(jīng)心室腔穿刺取血。取血后立即斷頭取腦，去除血液及腦膜，置于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4SOD和MDA測定血液經(jīng)2%的EDTA抗凝離心后取血清，分別按試劑盒說明書進行測定。

1.2.5觀察皮質(zhì)和海馬病理學(xué)變化分組取大腦，10%中性緩沖液福爾馬林固定4 h以上，石蠟包埋。冠狀連續(xù)切片8張（4 μm），HE染色, 免疫組化采用SP法，光鏡下觀察皮質(zhì)、海馬。

1.2.6神經(jīng)細細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的測定剝離腦皮質(zhì)和海馬組織，分別置于DMEM培養(yǎng)液中剪碎，用吸管吹打分散細胞，經(jīng)300目銅網(wǎng)過濾，離心后棄上清，0.01 mol/L PBS洗滌,臺盼藍排斥試驗檢查，細胞成活率達90%。細胞懸液在37℃水浴中預(yù)溫5 min，加入Fura 2·AM-1使終濃度為5 μmol/L，于37℃水浴中恒溫振蕩40 min進行負載。后以D Hank's液洗滌，并制成1×106/ml的單細胞懸液。采用Fluostar多功能微孔分析儀，激發(fā)波長340 nm和380 nm，發(fā)射波長505 nm，測定熒光強度，并按文獻公式計算出神細細胞內(nèi)游離鈣離子。

1.2.7流式細胞儀檢測細胞凋亡的定量分析[5-6]剝離腦皮質(zhì)和海馬組織，在冷70%乙醇中固定。用吸管吹打分散細胞，加入0.25%的胰蛋白酶液,37℃消化30 min,經(jīng)300目銅網(wǎng)過濾，0.01 mol/L PBS洗滌并制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106/ml。DAB顯色，采用TUNEL檢測法。將所得數(shù)據(jù)經(jīng)Macintosh 650型計算機上用CellQuestPlot軟件(BD公司生產(chǎn))分析數(shù)據(jù)，分析細胞的凋亡百分率（細胞凋亡率=凋亡細胞/總細胞數(shù)×100%）。細胞核棕黃色為凋亡細胞。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理，采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，各實驗組均數(shù)間的兩兩比較，若方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane's T2檢驗。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績的比較見表1。

2．2 芹菜甲素對擬癡呆大鼠血清中SOD及MDA的影響見表2。

2.3芹菜甲素對擬癡呆大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色(免疫組化×400)可見空白對照組大鼠皮質(zhì)、海馬區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)目多，排列緊密、均勻而整齊，胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)均勻，核仁明顯；模型組和腦復(fù)康組均見不同程度的神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)松散、數(shù)目減少、排列紊亂，胞核深染、固縮，有核仁消失，胞漿周圍發(fā)現(xiàn)空暈，胞間距較大，并可見不規(guī)則形膠質(zhì)細胞及散在的膠質(zhì)細胞增生小結(jié)，僅見少量正常神經(jīng)細胞；芹菜甲素組正常神經(jīng)細胞數(shù)目較多，排列較密，胞核圓或橢圓形，染色質(zhì)豐富，核仁清晰，少見固縮變性的神經(jīng)細胞。

2.4芹菜甲素對擬癡呆大鼠神經(jīng)細細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

模型組大鼠神經(jīng)細細胞內(nèi)游離鈣離子濃度較空白對照組升高(P<0.05)；芹菜甲素組游離鈣離子濃度降低(P<0.05)。

2.5芹菜甲素對擬癡呆大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響見表3。

在DNA直方圖上，模型組于G0/G1峰左側(cè)出現(xiàn)了一個明顯的亞二倍體峰（細胞凋亡峰），表明DNA的降解增多，芹菜甲素組的DNA直方圖中也可見到凋亡峰，但顯著低于模型組，空白對照組則未見明顯的凋亡峰。

3討論

芹菜甲素為傘形科植物旱芹的干燥成熟果實粉末狀提取物的有效成分。鋁作為一種神經(jīng)毒素，可能是導(dǎo)致AD 的病因之一。鋁可進入腦內(nèi)取代鈣和鎂離子，同氨基酸鏈上的谷氨酸或精氨酸的羧基結(jié)合形成谷氨鋁鹽或精氨酸鋁鹽的穩(wěn)定復(fù)合物而沉積于腦內(nèi)，引起tau蛋白異常磷酸化反應(yīng)，形成神經(jīng)元纏結(jié)，促進A β的形成而產(chǎn)生老年斑，破壞血、腦脊液屏障及改變腦細胞內(nèi)溶酶體活性,使自由基生成過多等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，患者出現(xiàn)記憶、語言、認知功能等進行性智能功能喪失和近記憶力障礙[7]。因為AD的是多成因發(fā)病和錯綜復(fù)雜的病理過程，筆者在使用D-半乳糖致亞急性衰老提供的一個老化背景的基礎(chǔ)上，再予鋁劑模擬AD，以形成多因素復(fù)合實驗性AD大鼠模型。這樣的復(fù)合模型可能較以前的單因素AD動物模型更貼近AD復(fù)雜的病理變化過程，尤其是更適合用于探討藥物多靶點作用機制和有效藥物篩選的研究模型[8]。通過實驗提示，該模型在學(xué)習(xí)記憶、細胞凋亡等方面都表現(xiàn)出廣泛的類AD的病理改變。

隨年齡的增長，氧自由基的清除能力退化，在體內(nèi)大量聚積，破壞細胞膜，可誘發(fā)細胞凋亡[9]。本實驗在應(yīng)用芹菜甲素后，治療組較模型組SOD活性升高,MDA 含量降低，表明可能通過減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護酶的活性，達到抗氧化作用，直接或間接清除D-半乳糖和三氯化鋁引起的自由基產(chǎn)生增多造成的損害，避免抗氧化性物質(zhì)消耗導(dǎo)致的腦組織損傷，也從另一個側(cè)面驗證了SOD的活性和MDA含量的改變在AD發(fā)病中的作用。

隨著老齡化的發(fā)生，細胞內(nèi)的Ca2+調(diào)控能力逐漸衰退，細胞膜上鈣通道開放和細胞內(nèi)鈣庫的釋放而引起胞內(nèi)Ca2+呈漸進性增加，鈣穩(wěn)態(tài)被破壞[10]。鈣超載使興奮性氨基酸過度釋放，產(chǎn)生自由基造成線粒體能量代謝障礙和神經(jīng)細胞骨架破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[11]。因此阻斷細胞鈣內(nèi)流，維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，也是保護細胞正常功能的一個重要手段之一[12]。本實驗結(jié)果顯示，芹菜甲素可以降低擬AD大鼠細胞內(nèi)的游離鈣離子濃度，通過維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，抑制了伴隨腦老化產(chǎn)生的鈣超載，對神經(jīng)細胞起到了保護作用。

凋亡是一種細胞主動參與的自毀過程，與細胞壞死有根本區(qū)別，它與細胞的增殖共同維持機體正常生長發(fā)育和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在細胞凋亡的諸多誘因中，體內(nèi)代謝或外源性因素產(chǎn)生的自由基均被證實可誘導(dǎo)細胞凋亡，細胞凋亡可能是機體氧化和抗氧化失衡的結(jié)果之一。細胞發(fā)生凋亡時,出現(xiàn)明顯的核固縮、斷裂、凝聚,形成凋亡小體[13]。

本實驗研究結(jié)果顯示通過激光共聚焦的形態(tài)學(xué)檢測和在流式細胞儀DNA定量分析圖譜上出現(xiàn)顯著的凋亡峰，結(jié)合芹菜甲素能提SOD 活性, 降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量, 減輕氧化應(yīng)激，清除自由基, 維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，抑制神經(jīng)元凋亡，抗腦萎縮多位點作用, 提示芹菜甲素具有較好的抑制AD發(fā)生的作用，也為開發(fā)中藥及其提取物從多環(huán)節(jié)防治AD提供了客觀的理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1]孫治坤, 陳生弟.阿爾茨海默病發(fā)病機制中Aβ和Tau蛋白磷酸化的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2007,87(29):2028-2030.

[2]魯遠君,余昌胤.阿爾茨海默病中針對tau蛋白治療的研究進展[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2008，15（3）：211-213.

[3]余升紅.阿爾茨海默病發(fā)病機理[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2007,13(3)：127-128.

[4]李儀奎.中藥藥理實驗方法學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991：171-173.

[5]左連富.流式細胞樣品制備技術(shù)[M].北京:華夏出版社，1991：14-19

[6]馬文新.流式細胞儀在細胞凋亡檢測中的應(yīng)用[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，1999，（9）13-16.

[7]Drzezga A，Riemenschneider M，Strassner B，et al.Cerebral glucose metabolism in patients with AD and different APOE genotypes[J].Neurology，2005，64(1)：102-107.

[8]羅煥敏,翁文.老年性癡呆動物模型的制作與選擇[J].中華老年多器官疾病雜志,2007,6(1):12-16.

[9]Jing G，Grammatopoulos T，F(xiàn)erguson P.Inhibitory effects of angiotensin on NMDA induced cytotoxicity in primary neuronal cultures[J].Brain Res Bull，2004,62(5):397-403.

[10]王冰,康軍,王佩,等.正丁基苯酞對癡呆小鼠海馬鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα表達的影響[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2007,26(10):775-776.

[11]Wolfe MS. Therapeutic strategies for Alzheimer's disease[J].Nat Rev Drug Discov,2002,1(11): 859-866.

[12]周曉輝,徐明明.神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載與阿爾茨海默病關(guān)系研究進展[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2007，26（11）:878.

[13]姜泊.細胞凋亡基礎(chǔ)與臨床[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,1999:307.

(收稿日期：2009-02-10)