夏春森　韋史利　鐘艷紅

【摘要】目的：建立黃芪有效部位多糖的含量測定方法。方法：用優(yōu)化后的3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定黃芪有效部位多糖的含量。結果：DNS試劑的用量為2ml，顯色溫度為100℃，顯色時間為5min，在500nm處多糖含量與吸光度有良好的線性關系，平均回收率為100.6%，RSD=1.79%（n=5）。結論：該方法操作簡便，測定結果準確，重復性好，可用于測定黃芪多糖的含量。

【關鍵詞】黃芪;多糖;3,5-二硝基水楊酸法

【中圖分類號】R931.5【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)08-0013-02

Determination of Polysaccharides in Astragalus membranaceus with DNS Method

XIA Chun-seng1猈EI Shi-li2猌HONG Yan-hong1

(1. Yangtze River Pharmaceutical Holding Guangzhou Hairui Pharmaceutical CO.,Ltd, Guangzhou 510663,China;

2.New Drug Research and Development Center, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405,China)

【Abstract】 Objective To establish a method for the determination of polysaccharides in Astragalus membranaceus. Method Using optimized DNS colorimetric method to determine the polysaccharides. Result The conditions were as follows: 3,5-dinitrosalicylic acid 2.0ml,aqueous bath temperature 100℃, and active time 5min.There was a good liner relationship between the concentration of polysaccharides and the absorbance at the wavelength of 500nm. The average recovery was 100.6%, RSD=1.79%(n=5).Conclusion The method is convenient, accurate with good reproducibility and can be used for the determination of polysaccharides in Astragalus membranaceus.

【Keywords】polysaccharide;Astragalus membranaceus;3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry

黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.Var.mongholicus(Bge.) Hisao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，具補中益氣、升陽固表 、托毒生肌、利水退腫之功^[1]。セ棲味嗵鞘腔棲蔚撓行С煞種一，現代藥理學研究表明，具有抗衰老 、抗過氧化、 促進免疫功能活性、改善心血管功能^[2]、抗腫瘤等作用^[3]。多糖的檢測方法可分為二大類。一類是直接測定多糖本身，如高效液相色譜法和酶法；另一類是利用苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法、3,5-二硝基水楊酸法等測定多糖。前者需昂貴的儀器、多糖純品和特定的酶，而且操作繁瑣，在應用中受到限制；后者方法簡單、快速。本文采用3,5-二硝基水楊酸法測定黃芪有效部位多糖的含量。

1材料與儀器

1.1儀器HH-S恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市正基儀器有限公司）；AB204-N電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Thermo Helios型紫外分光光度計（美國UNICAM公司）。

1.2材料D-無水葡萄糖對照品（中國生物制品檢定所，批號為110833-200503）；黃芪粗多糖（揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號為081008，0081012，081017，081022）；3,5-二硝基水楊酸（批號：20061211，廣東光華化學廠有限公司）；其它試劑均為分析純。

1.33,5-二硝基水楊酸試液的配制^[4]甲液：稱取6.9g苯酚溶于10%氫氧化鈉的溶液15.2ml中，用水稀釋至69ml，并在此溶液中加入6.9g亞硫酸氫鈉；乙液:稱取255g酒石酸鉀鈉加至300ml30%氫氧化鈉溶液中，再加880ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液，混勻，即得。甲液與乙液混合，儲存于棕色瓶中，7天后使用。

2方法與結果

2.1對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷干燥的D-無水葡萄糖對照品10.2mg，置于50ml容量瓶中，加適量水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備精密稱取黃芪粗多糖約35mg，置于25ml容量瓶中，加適量水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.1總糖溶液的制備^[5，6]精密量取供試品溶液2.5ml，置于25ml容量瓶中，加水使成5ml，加6mol/L鹽酸溶液5ml，在沸水浴中加熱30min，用流水冷卻后加酚酞指示液1滴，用20%氫氧化鈉溶液調節(jié)至微紅色，加水至刻度，搖勻，即得。

2.2.2單糖溶液的制備^[5，6]精密量取供試品溶液5ml，置于10ml容量瓶中，加酚酞指示液1滴，用20%氫氧化鈉溶液調節(jié)至微紅色，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3測定方法

2.3.1最大吸收波長的確定精密量取對照品溶液0.8ml、總糖溶液和單糖溶液各2ml，分別置于10ml具塞刻度試管中，加水使成2ml，分別精密加入3,5-二硝基水楊酸試液2ml，混勻，在100℃水浴中加熱5min，取出，立即用冰水浴冷卻至室溫，加水3ml，搖勻，用相應的試劑作空白，照分光光度法在400～600nm的波長范圍掃描。對照品溶液、總糖溶液和單糖溶液均在500nm有最大吸收，掃描圖見圖1。

2.3.2標準曲線的繪制精密量取對照品溶液0.0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，分別置于10ml刻度試管中，照“2.3.1”項下自“加水使成2ml”起，依法顯色，在500nm測定吸收度，結果見表1，繪制標準曲線，回歸方程Y=32.838X-0.2474，R²=0.9995，在11.7μg/ml～35.0μg/ml內線性關系良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗精密量取對照品溶液0.8ml、總糖溶液和單糖溶液各2ml，分別置于10ml具塞刻度試管中，照“2.3.1”項下自“加水使成2ml”起，依法顯色，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0小時測定吸收度。結果對照品溶液吸收度平均值為0.529，RSD%=1.14%（n=5）；總糖吸收度平均值為0.518，RSD%=1.59%（n=5）；單糖吸收度平均值為0.233，RSD%=1.71%（n=5）。說明本品在2小時內顯色穩(wěn)定。

2.3.4精密度試驗精密量取總糖溶液和單糖溶液2ml，各5份，分別置于10ml具塞刻度試管中，照“2.3.1”項下自“加水使成2ml”起，依法顯色，測定吸收度。結果總糖吸收度平均值為0.524，RSD%=1.06%（n=5）；單糖吸收度平均值為0.231，RSD%=1.37%（n=5）。說明本法精密度良好。

2.3.5重復性試驗取同一批的黃芪粗多糖樣品制備供試品溶液5份，進行含量測定。結果樣品中多糖含量平均為51.1%，RSD%=1.92%。

2.3.6樣品加樣回收試驗^[5]精密稱取黃芪粗多糖（批號：070408）5份，每份約17.5mg，精密加入對照品適量，按含量測定方法測定，結果表明本法回收率良好，見表2。

2.3.7樣品多糖含量測定精密量取總糖溶液和單糖溶液2ml，分別置于10ml具塞刻度試管中，照“2.3.1”項下自“加水使成2ml”起，依法顯色，測定吸收度，從標準曲線中回歸方程計算出總糖和單糖含量，由總糖含量減去單糖含量，即得多糖的含量。對4批樣品進行多糖含量測定，結果見表3。

3討論

3.1多糖含量測定方法的選擇測定黃芪多糖含量的方法，還有苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法^[7]，這兩種方法測定多糖含量時，無法去掉單糖成分的干擾，測定結果比實際含量偏高，而且兩種方法都用到硫酸，硫酸遇水劇烈放熱，從而顯色條件難以控制，影響測定結果，導致線性考察不穩(wěn)定，高濃度硫酸具有嚴重的腐蝕性，不便操作。與前兩種方法比較，3,5-二硝基水楊酸法試劑較穩(wěn)定，操作簡便、快速，靈敏度高，在去除了單糖成分的干擾之后，測定結果準確，能夠廣泛應用。

3.2顯色條件的考察

3.2.1反應時間精密吸取對照品溶液0.8ml，平行5份，置于10ml具塞刻度試管中，加水使成2ml，精密加入3,5-二硝基水楊酸試液2.0ml，混勻，分別在100℃水浴中加熱1、3、5、7、9min，取出，立即用冰水浴冷卻至室溫，加水3.0ml，搖勻，用相應的試劑作空白，在500nm測定吸收度。反應1min吸光度很小，反應3min以后，吸光度基本無變化，綜合考慮，選擇5min為反應時間。

3.2.2反應溫度精密吸取對照品溶液0.8ml，平行5份，置于10ml具塞刻度試管中，加水使成2ml，精密加入3,5-二硝基水楊酸試液2.0ml，混勻，分別在60、70、80、90℃和沸水浴中加熱5min，取出，立即用冰水浴冷卻至室溫，加水3.0ml，搖勻，用相應的試劑作空白，在500nm測定吸收度。反應溫度為60、70、80℃時，吸光度較低，90℃和沸水浴時吸光度較高但相差不大，綜合考慮，選擇沸水浴為反應溫度。

參考文獻

[1]鄭虎占,董澤宏,余靖.中藥現代研究與應用[M].北京：學苑出版社，1998：2729

[2]包文奇,呂美,王志祥.黃芪多糖的藥理研究進展[J].河南農業(yè)科學，2005，(4):78～79

[3]馬宏秀,張治祥.黃芪的藥理研究進展[J].陜西中醫(yī)學院學報，2004，27(5):73－75

[4]張信旭,高海波.3,5-二硝基水楊酸測定古尼蟲草中多糖含量方法[J].貴州化工，2002，27(3):23－25,38

[5]王紅英,錢斯日古愣,趙前程，等.3,5-二硝基水楊酸比色法測定麥冬多糖含量[J].沈陽農業(yè)大學學報，2005，36(5):628－630

[6]陳齊英,孫雪奇,徐曉霞.3,5-二硝基水楊酸比色法測定亮菌口服液中多糖的含量[J].華西藥學雜志，2000，15(3):193

[7]楊莉,王志華,陶健生.黃芪中黃芪多糖含量測定方法的比較[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(9):562－563

(收稿日期：2009.02.15)