張　鳳

【摘要】本文對兩種生化指紋圖譜技術(shù)在作物品種鑒定中的應(yīng)用及研究作了綜述，并對他們的優(yōu)缺點和前景作了探討。

【關(guān)鍵詞】生化指紋圖譜；品種鑒定；種子純度

指紋圖譜是指能夠鑒別生物個體之間差異的電泳圖譜，此電泳圖譜多態(tài)性豐富，具有高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，像人的指紋一樣，因而被稱為“指紋圖譜”。它是鑒別品種、品系的有力工具，指紋圖譜技術(shù)具有可靠方便、準(zhǔn)確快速、不受環(huán)境影響等特點，反映了個體間的內(nèi)在差異，因而極其適合于品種的鑒定工作。

目前在品種鑒定中應(yīng)用較多的指紋圖譜主要有兩種：一類是較早開始研究的生化指紋圖譜，包括同工酶電泳指紋圖譜和蛋白電泳指紋圖譜。另一類是九十年代之后發(fā)展起來的DNA指紋圖譜，目前用于作物品種鑒定的主要有四種：RFLP、RAPD、SSR、AFLP。本文就兩種生化指紋圖譜技術(shù)的研究和應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。

1.同工酶電泳指紋圖譜

同工酶差異主要是由決定酶蛋白本身的等位基因和非等位基因的差異造成，同工酶譜是基因表達(dá)后分子水平的表型，通過其譜帶的分析能快速簡便的識別出編碼這些譜帶的基因位點和等位基因。由于幾乎25％的基因位點具有多態(tài)性,一般不同同工酶酶譜的差異表現(xiàn)為同一基因位點上的等位基因的差異，在分離群體中能區(qū)分所有可能的基因型，因而可用作指紋圖譜。

從1959年Market和Moller首次提出同工酶的概念以來，同工酶研究得到了迅猛發(fā)展。70年代初期，同工酶電泳技術(shù)就應(yīng)用于種子純度鑒定。1973年，Singh利用酯酶同工酶、亮氨酸氨肽酶及磷酸酶同工酶的淀粉凝膠電泳，對10個燕麥品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，每個品種都具有其特有的酶帶，證明了利用同工酶電泳鑒定種子純度的可靠性。1976年，Woods對抱球甘藍(lán)進(jìn)行了同工酶的淀粉凝膠電泳鑒定。

80年代以后，電泳方法不斷改進(jìn)，分析技術(shù)越來越精確，逐漸采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。Nielsen（1986）綜合分析了1979-1986年間不同同工酶和不同電泳方法在大麥品種純度上的鑒定后，認(rèn)為聚丙烯酰胺凝膠電泳法是最具有潛力的品種純度鑒定方法。利用這一技術(shù)，F(xiàn)reeman（1991）對早熟禾種子純度進(jìn)行了鑒定，并制作了一系列早熟禾品種的酯酶同工酶酶譜，以便于對照比較。國內(nèi)，最早將這項技術(shù)應(yīng)用于種子純度鑒定的陸士偉[1]利用酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳測定了雜交水稻種子的純度。顏啟傳[2]利用這一技術(shù)檢測了雜交水稻及其三系種子的真實性和品種純度，研究證明此方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、易于操作等優(yōu)點。張春慶[3]利用過氧化物同工酶電泳鑒定了玉米自交系及其雜交種的純度，取得較好的效果。

90年代以后，同工酶電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物品種純度鑒定上，許多工作者在水稻、玉米、大白菜等作物品種純度鑒定方面做了大量的工作，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。

同工酶電泳酶帶的顯現(xiàn)靈敏，較易獲得成功，一次可進(jìn)行多種酶的分析，從而大大提高了種子純度檢測的功效，具有速度快、費用低、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點[4]，因此一度應(yīng)用于作物純度檢測。然而，同工酶的表達(dá)在時間和空間上的特異性又影響著同工酶在不同組織或器官中的分布與活性。酶的提取和電泳技術(shù)的實驗條件要求嚴(yán)格，可利用的同工酶非常有限,并有酶譜不純的現(xiàn)象，因而在生產(chǎn)實踐中未得到推廣應(yīng)用。

2.蛋白電泳指紋圖譜

蛋白質(zhì)作為基因的直接穩(wěn)定產(chǎn)物，能反映生物DNA組成上的差異，但適合鑒定品種的基因產(chǎn)物必須在品種間存在較高的多態(tài)性，且易于檢測出來。植物胚乳（種子）貯藏蛋白就是符合要求的一類基因產(chǎn)物，這些蛋白的組成由遺傳決定，不受環(huán)境影響，其組分上的差異可反映出基因型的不同，因而可作為品種的“生化指紋”。

自70年代以來，蛋白質(zhì)電泳作為鑒定品種的一種方法引起了人們的極大興趣。Ellis（1977）利用淀粉凝膠電泳分析了29個英國小麥品種的醇溶蛋白，除極個別外，這些品種都能被區(qū)分開。他們認(rèn)為，每品種分析50粒種子，既不需花費很多時間，又能保證結(jié)果統(tǒng)計的準(zhǔn)確性。Shewry（1978）利用SDS-PAGE技術(shù)對大麥種子醇溶蛋白進(jìn)行了分析，成功地將88個大麥品種分為29個種類，顯示了醇溶蛋白電泳技術(shù)在品種鑒定上的巨大價值。Lookhart（1982）建立了一種標(biāo)準(zhǔn)化的麥醇溶蛋白鑒定技術(shù)。1986年，國際種子檢驗協(xié)會將大麥、小麥品種醇溶蛋白電泳鑒定技術(shù)列入國際種子檢驗規(guī)程。Cross對玉米的胚蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，成功區(qū)分了自交系和雜交種。Anisimova（1989）對53個向日葵品種的球蛋白電泳圖譜進(jìn)行比較，表明球蛋白多態(tài)性豐富，可用于品種、自交系同質(zhì)性和遺傳純度的鑒定。Varier（1992）利用球蛋白的SDS-PAGE技術(shù)對向日葵的4個雜交種及其親本自交系進(jìn)行了研究，總共檢測到了27條帶，除3條共有帶外，其他帶的有無可以決定品種間基因型的不同。

此后，蛋白質(zhì)電泳鑒定種子純度技術(shù)迅速發(fā)展起來，廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、番茄等作物。同時電泳技術(shù)也日臻完善，在品種鑒定和純度分析中主要有以下兩種方法，即根據(jù)蛋白質(zhì)等電點不同來分離的等電聚焦電泳法（IEF）和根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同來分離的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。此外，毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）、超薄等電聚焦電泳技術(shù)（UTLIEF）、酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（Acid-PAGE）、雙向電泳技術(shù)（2-D）、高效液相色譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分離方面也有很多應(yīng)用，并顯示了強大的優(yōu)勢。

蛋白質(zhì)電泳技術(shù)是目前種子純度檢驗中廣泛適用的方法。蛋白質(zhì)提取容易，無需低溫，需時較短，成分?jǐn)?shù)量穩(wěn)定，具有較高的準(zhǔn)確性和廣泛的適應(yīng)性[5]。但值得注意的是，由于基因表達(dá)有時會受到器官、發(fā)育階段甚至環(huán)境條件的影響，故進(jìn)行電泳鑒定時，除了電泳條件的適當(dāng)選擇外，試驗材料的采集也直接影響了鑒定的準(zhǔn)確性。另外對于某些遺傳組成非常接近的品種，如保持系和不育系，不易找到特異蛋白，采用蛋白質(zhì)電泳難以發(fā)現(xiàn)特征帶。此外，蛋白質(zhì)電泳圖譜易受種子發(fā)育階段及表達(dá)器官的影響，有時不夠穩(wěn)定，影響了電泳圖譜的分析，從而影響了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。并且，隨著近幾年雜交組合的不斷推陳出新，品種之間的差異甚微，親緣關(guān)系較近，鑒定更加困難。

3.結(jié)語

純度是種子重要的質(zhì)量指標(biāo)，也是種子分級的主要依據(jù)。低純度、真實性差的種子給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來極大的損失。再者，在短期經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動下，一些不法分子常以犧牲種子純度為代價來獲取高額利潤，損害消費者的利益，嚴(yán)重影響了正常的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，成為全國良種推廣、總產(chǎn)提高的一大潛在障礙。指紋圖譜標(biāo)記是近年來發(fā)展快、應(yīng)用面廣、準(zhǔn)確性較高的種子純度鑒定方法，它在分子水平上對不同遺傳特性的種子給予辨別，有準(zhǔn)確、可靠、快速和不受外界環(huán)境條件影響的特點。采用指紋圖譜技術(shù)建立一套主要作物的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，對防止偽劣種子流入市場，提高種子市場規(guī)范化具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]陸士偉,黃炳權(quán),鄺章標(biāo)等.應(yīng)用酯酶同工酶測定雜交水稻雜種純度的研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1982,(15):10

[2]顏啟傳.雜交水稻三系及其雜交種種子真實性鑒定和純度檢驗.種子,1984,(3):15-18

[3]張春慶等.NAV-PAGE技術(shù)與玉米種子純度測定.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1995,（6）：20-24

[4.]文方德,李卓杰，傅家瑞.種子純度鑒定技術(shù)進(jìn)展及其評論.種子,1995,(5):36-38

[5]嚴(yán)莉等.現(xiàn)代生物技術(shù)在作物品種純度鑒定上的研究進(jìn)展.種子,2002,(6):45-46

[6] 管曉春,劉康.淺談種子純度及真實性室內(nèi)鑒定.種子,1998,(3):74-76

作者簡介：張鳳（1979—），女，研究生，講師，研究方向：植物分子發(fā)育生物學(xué)。