劉曉萃 王明召

摘要 以高中化學(xué)新課標(biāo)教材中有關(guān)氨基酸、蛋白質(zhì)的知識(shí)為切入點(diǎn),介紹綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生色團(tuán)與發(fā)光特性、優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用,為一線教師提供前沿化學(xué)知識(shí)。

關(guān)鍵詞 高中化學(xué);綠色熒光蛋白;新課標(biāo)

中圖分類號(hào):G633.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):1671-489X(2009)24-0030-02

Introduction of Green Fluorescent Protein: To Help Implementation of New Curriculum Standard//Liu Xiaocui, Wang Mingzhao

Abstract The structure, chromophore, fluorescent property, advantage and application of the green fluorescent protein was briefly introduced in this paper, aimed to offer the frontier chemistry for the senior chemistry teachers.

Key words senior chemistry; green fluorescent protein; new curriculum standard

Authors address Institute of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing, 100875, China

近年來(lái),綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)因其穩(wěn)定性和獨(dú)特發(fā)光性能而成為在分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的工具。2008年,瑞典皇家科學(xué)院將諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予GFP的發(fā)現(xiàn)者和推廣者下村修、馬丁·查爾菲和錢永健,并將GFP的發(fā)現(xiàn)和改造與顯微鏡的發(fā)明相提并論。

1 發(fā)光特性

從水母分離出的GFP呈非常穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu),顯酸性,分子量為27×103 D,含238個(gè)氨基酸。GFP是一個(gè)生物發(fā)光系統(tǒng),具有激發(fā)后能發(fā)射熒光的發(fā)光色基。它能吸收藍(lán)光(在395 nm具有最大吸收),發(fā)射綠色(或黃綠色)熒光,最大發(fā)射波長(zhǎng)509 nm,并在470 nm處有一肩峰。只有完整的GFP分子才會(huì)產(chǎn)生生物熒光,切斷的GFP(即使只切掉C、N末端的少數(shù)幾個(gè)氨基酸)喪失發(fā)光能力[1,2]。

2 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

GFP呈非常特殊的β罐折疊方式(圖1)。11條β折疊片形成一個(gè)桶狀結(jié)構(gòu),1條α螺旋纏繞在桶的軸位置,生色團(tuán)附著在α螺旋上,包埋于中心[3,4],受到保護(hù)。β折疊片彼此緊密結(jié)合,形成一個(gè)規(guī)則的氫鍵帶,構(gòu)成外圍桶板。桶狀結(jié)構(gòu)、其末端的α螺旋、環(huán)狀生色團(tuán)一起組成一個(gè)單獨(dú)的致密結(jié)構(gòu)域,其他分子不能擴(kuò)散進(jìn)入,因此具有很好的抗熱、抗變性劑能力。由于酶很難進(jìn)入其內(nèi)部,生色基團(tuán)的生成只能自催化進(jìn)行[5]。

3 生色團(tuán)與發(fā)光[3-6]

生色團(tuán)是GFP發(fā)出熒光的物質(zhì)基礎(chǔ),位于64～69位氨基酸。第65位絲氨酸(Ser65)—第66位脫氫酪氨酸(Tyr66)—第67位甘氨酸(Gly67)通過(guò)共價(jià)鍵形成對(duì)羥苯甲基咪唑環(huán)酮,形成一個(gè)相當(dāng)穩(wěn)定的環(huán)狀三肽,構(gòu)成生色團(tuán)的核心,如圖2所示。

生色團(tuán)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)的作用或自催化作用都能產(chǎn)生,不受種屬的限制。它非常穩(wěn)定,不易變性,用酸、堿處理或者加入鹽酸胍都不會(huì)使它失去熒光。處理后當(dāng)pH值恢復(fù)中性或除去變性物時(shí),其熒光又會(huì)恢復(fù)到變性前水平。生色團(tuán)之間通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合。

早已發(fā)現(xiàn)生色團(tuán)核心的形成是一個(gè)自催化過(guò)程,唯一的外部要求是存在分子氧,據(jù)此推斷β罐結(jié)構(gòu)很可能是生色團(tuán)形成的至關(guān)重要條件。β罐既對(duì)生色團(tuán)起保護(hù)作用,又為其形成提供合適的反應(yīng)空間。其中,Ser65的羰基碳與Gly67的酰胺氮之間的距離明顯比開(kāi)環(huán)條件下短很多,這有利于內(nèi)環(huán)的形成。

生色團(tuán)的形成機(jī)理目前尚不十分清楚,一種可能的自催化形成機(jī)理如圖3所示。生色團(tuán)的形成大致經(jīng)過(guò)環(huán)化、脫水和氧化3個(gè)過(guò)程。在β罐中,Ser65的羰基碳與Gly67的酰胺氮之間成鍵環(huán)化(I→Ⅱ),并發(fā)生氫轉(zhuǎn)移(Ⅱ→Ⅲ)和脫去水分子(Ⅲ→Ⅳ),然后通過(guò)氧化形成穩(wěn)定的環(huán)狀三肽(Ⅳ→Ⅴ)。這時(shí)形成的GFP(Ⅴ)雖然也具有和發(fā)光GFP相同的凝膠電泳行為,但不能發(fā)光。必須在分子氧存在的情況下,Tyr66由質(zhì)子化狀態(tài)(酚羥基)脫氫轉(zhuǎn)變成脫質(zhì)子態(tài)(酚鹽,Ⅴ→Ⅵ),GFP才能發(fā)光。原因是酸性酚的激發(fā)態(tài)遠(yuǎn)大于其基態(tài),只有脫質(zhì)子態(tài)的能級(jí)才能匹配。

4 優(yōu)點(diǎn)[1,2,7]

4.1 易于檢測(cè)GFP只需紫外光或藍(lán)光激發(fā),即可發(fā)出用熒光顯微鏡甚至肉眼就可觀察到的綠色熒光,且靈敏度高,可識(shí)別單細(xì)胞水平的表達(dá),還可定量檢測(cè)。它對(duì)活細(xì)胞基本無(wú)毒害,可以很方便地進(jìn)行活體觀察。

4.2 熒光穩(wěn)定GFP熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性高,無(wú)光漂白現(xiàn)象,在pH值7～12范圍內(nèi)都可以正常發(fā)光,溫度超過(guò)65 ℃時(shí)才會(huì)變性使熒光消失,也能耐受長(zhǎng)時(shí)間光照。

4.3 廣譜性GFP的表達(dá)幾乎不受種屬的限制,在微生物、植物、動(dòng)物中都獲得成功的表達(dá)。也不受細(xì)胞種類和位置的限制,在各個(gè)部位都可以表達(dá),在多種原核和真核生物細(xì)胞中都可表達(dá)發(fā)光。

4.4 易于載體構(gòu)建GFP較小,編碼GFP的基因序列也較短,可以很方便地同其他序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒,不至于使質(zhì)粒過(guò)大影響轉(zhuǎn)化頻率。野生型的GFP在某些植物和動(dòng)物中表達(dá)很弱,可通過(guò)更換生色團(tuán)氨基酸、改變堿基組分、除去內(nèi)含子、更換強(qiáng)啟動(dòng)子等方法加強(qiáng)表達(dá)。替換一些氨基酸可產(chǎn)生不同顏色的光,以適應(yīng)不同研究的需要。

4.5 可進(jìn)行活細(xì)胞定時(shí)定位觀察借助于近年激光掃描共聚焦顯微鏡和強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)軟件,可進(jìn)行三維顯示,通過(guò)GFP可實(shí)時(shí)觀察到外界信號(hào)刺激下目的蛋白的變化過(guò)程,使對(duì)活細(xì)胞中蛋白功能的研究更接近自然狀態(tài)。

5 應(yīng)用[1,2,5,8]

5.1 用作報(bào)告基因和細(xì)胞標(biāo)記最多和最成功的應(yīng)用是GFP同宿主蛋白構(gòu)成融合子來(lái)監(jiān)測(cè)宿主蛋白的定位和最后歸宿,既能發(fā)出熒光又有宿主蛋白正常功能和定位的融合蛋白效果最佳。GFP可融合于宿主蛋白的N端或C端,也可插入其內(nèi)部。至今GFP已成功靶入大部分細(xì)胞器中,如質(zhì)膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、分泌小體、線粒體、液泡和吞噬體等。

5.2 研究活細(xì)胞的蛋白變化過(guò)程、細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)和內(nèi)膜運(yùn)輸通過(guò)GFP可研究某一蛋白在活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化,藥物對(duì)蛋白功能影響的動(dòng)態(tài)過(guò)程以及蛋白之間的相互作用,免除提純蛋白、標(biāo)記上熒光染料、用顯微注射導(dǎo)入細(xì)胞的復(fù)雜操作,并可對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的某一蛋白進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤,研究其分子機(jī)制。

5.3 計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)速度在高水平組合型表達(dá)GFP的細(xì)胞品系中,在細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期,GFP發(fā)出的熒光信號(hào)與細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān),可將熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成細(xì)胞濃度。

5.4 臨床診斷和基因治療研究GFP標(biāo)記的抗原或抗體可作為一種簡(jiǎn)便、快速的免疫診斷新技術(shù)。例如,利用基因工程技術(shù)表達(dá)的GFP HB Ve抗原融合蛋白兼有熒光和抗原活性,實(shí)現(xiàn)用GFP標(biāo)記肝炎病毒抗原的目標(biāo)。腫瘤的基因治療中用GFP作為標(biāo)記基因,不但可以直接通過(guò)FITC系統(tǒng)觀察到基因轉(zhuǎn)化,而且可直接收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞供試驗(yàn),大大縮短篩選時(shí)間。

6 展望[1,2,5]

目前GFP的基礎(chǔ)理論研究遠(yuǎn)不如應(yīng)用研究,應(yīng)用中也存在許多問(wèn)題。例如:熒光強(qiáng)度的非線性性質(zhì)使其定量非常困難;新生GFP折疊和加工成為具有熒光活性形式的過(guò)程十分緩慢,某些快速過(guò)程如轉(zhuǎn)錄的激活過(guò)程還難以用該法進(jìn)行研究;紫外激發(fā)對(duì)某些GFP有光漂白和光破壞作用,導(dǎo)致熒光信號(hào)快速喪失;多數(shù)生物具有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象,并有著類似的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng),這會(huì)影響某些GFP的檢測(cè)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,隨著GFP的基礎(chǔ)理論研究的深入,這些問(wèn)題終將得到解決。GFP一定可以為人們揭開(kāi)生命科學(xué)中許多至今還不為人知的秘密。

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