何新平　劉競芳　譚慧敏

[摘要] 目的 評價多重PCR在快速診斷社區(qū)獲得性肺炎病原體中的作用。方法 提取痰液標本中的DNA，擴增病原體DNA后電泳并觀察其結果，同時給予普通PCR或分離培養(yǎng)作為對照。結果 成功檢測出32例感染者，與普通PCR符合率達100%，敏感性高于分離培養(yǎng)。結論 多重PCR能高通量、快速診斷病原體，值得臨床進一步推廣。

[關鍵詞] 多重PCR；社區(qū)獲得性肺炎；病原體

[中圖分類號] R563.1 [文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2009）12-57-02

Detection of Pathogens in Patients with Community-acquired Pneumonia by Multiplex PCR

HE XinpingLIUJingfangTAN Huimin

Department of the Elderly Officials，Changsha Central Hospital， Changsha 410007

[Abstract] Objective To observe the rapid diagnosis value of multiplex PCR in patients with community-acquired pneumonia. Methods DNA was extracted and amplified from sputum. Common PCR or separation cullture was used as control. Results Pathogens were amplified from 32 patients，compared with common PCR，the coincidence was 100%，but the sensitivity was higher than separation cullture. Conclusion Multiplex PCR is a high-flux，repid method for clinical diagnosis of pathogens.

[Key Words] Multiplex PCR； Community-acquired pneumonia； Pathogen

社區(qū)獲得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）是指在醫(yī)院外罹患的感染性肺實質（含肺泡壁，即廣義上的肺間質）炎癥，包括具有明確潛伏期的病原體感染而在入院后潛伏期內發(fā)病的肺炎[1]。傳統(tǒng)的病原學診斷包括分離培養(yǎng)以及PCR。然而對于部分難以培養(yǎng)的病原體如肺炎支原體，常規(guī)的方法難以達到快速診斷的目的，普通PCR也存在監(jiān)測通量低等問題[2]。本文采用多重PCR（multiplex PCR）就2006～2008年來我院住院的CAP患者進行了相應比較研究，旨在對多重PCR的臨床應用作出初步評價。

1材料與方法

1.1材料

Tag酶，dNTPs，PCR緩沖液，引物合成等均來自上海生物工程有限公司；DNA抽提試劑盒購自QiaGen公司；PCR儀為德國Eppendorf公司產品；普通肉湯葡萄糖培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基購自上海美季生物技術有限公司。其余所有生化試劑均為分析純。

1.2病例選擇及標本來源

本研究所采用的76例痰標本均來自本院住院的CAP患者，所有患者肺部感染的符合中華醫(yī)學會2006年制定的《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》標準[3]，其中男性44例，女性32例，年齡41～74歲，平均52.5歲。痰標本分別來自上述76例患者，均為清晨清潔口腔后的一口來自肺深部的痰，所有患者取材前2w內均未接受抗菌藥物治療。

1.3方法

1）檢測肺炎球菌、肺炎衣原體、肺炎支原體和流感嗜血桿菌的多重PCR引物信息見表1[4]。20μl反應體系中加入標本DNA 2μL，擴增方案為：94℃變性10min，然后94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min，共40循環(huán)。最后一循環(huán)，72℃延伸7min。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析。所有病原體同時通過普通PCR做對照。判斷標準：擴增產物條帶電泳位置與Marker電泳位置相同者為該菌陽性。2）細菌培養(yǎng)：痰標本經常規(guī)處理后接種于普通培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基上，37℃孵育24～48h行革蘭染色及有關生化反應鑒定。

2結果

2.1 多重PCR與普通PCR檢測結果

多重PCR與普通PCR檢測結果完全一致。痰標本同時進行多重PCR和普通PCR檢測，兩者均檢測出肺炎球菌14例，肺炎衣原體2例，肺炎支原體5例，流感嗜血桿菌11例，其中有25份標本為以上4種菌的混合感染。多重PCR與普通PCR的符合率達100%。

2.2多重PCR與細菌培養(yǎng)結果比較

76份標本中經細菌培養(yǎng)法分離出肺炎球菌11例，流感嗜血桿菌8例。其分離的敏感性略低于多重PCR法。多重PCR檢測以上4種菌陰性的44例患者中無一例培養(yǎng)陽性。

3討論

CAP是威脅人類健康的常見感染性疾病之一，病原學往往十分復雜，通常為混合感染。因此，精確的病原學診斷不僅是確診的重要依據，也是合理選擇治療方案的基礎。目前病原學檢查主要以培養(yǎng)為主，但通常需要耗時達3d左右，而且操作繁瑣，影響因素多。相對而言，分子生物學技術如PCR，在時耗、敏感性及特異性方面均具有分離培養(yǎng)無法比擬的優(yōu)勢，但面對眾多復雜的病原微生物，檢測通量一直是其瓶頸[2]。多重PCR技術反應原理，反應試劑和操作過程與普通PCR相同。由于能在同一反應試管內同時檢出多種病原體，大大節(jié)省了時間和經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，多重PCR方法能在與普通PCR幾乎相同的時間內檢測出4種病原體，其檢測的所有的陰性患者中，通過普通培養(yǎng)或PCR法加以對照后顯示，其假陽性率為0'其敏感性和特異性均與普通PCR相同，因此該方法非常適合混合感染（如CAP）的病原學診斷，因而更具有廣闊的臨床應用前景。與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)相比，敏感性更高，對于難以培養(yǎng)的肺炎衣原體、肺炎支原體，其優(yōu)勢更加明顯[5]。

盡管如此，但多重PCR也具有普通PCR一樣的缺陷，如假陽性、假陰性問題，以及不同的DNA提取方法可能反應結果有所不同[6]。因此臨床醫(yī)師在下結論是應該慎重。另外，多重PCR的費用問題也在很大程度上限制了其廣泛應用，但考慮到其具有其他方法無可比擬的優(yōu)勢[7，8]，筆者認為將其應用于臨床并非夢想。

[參考文獻]

[1] 何禮賢. 社區(qū)獲得性肺炎的診治進展[J]. 臨床肺科雜志，2005，10（1）：2.

[2] Morozumi M，Hasegawa K，Chiba N，et al. Application of PCR for Mycoplasma pneumoniae detection in children with community-acquired pneumonia[J]. J Infect Chemother，2004，10（5）：274-279.

[3] 中華醫(yī)學會呼吸病學分會. 社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2006年修訂版）[J]. 中華結核和呼吸雜志，2006，29（10）：651-655.

[4] 吳移謀. 支原體學[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：138.

[5] Greco G，Corrente M，Martella V，et al. A multiplex-PCR for the diagnosis of contagious agalactia of sheep and goats[J]. Mol Cell Probes，2001，15（1）：21-25.

[6] Loens K，Ursi D，Goossens H，et al. Molecular diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections[J]. J Clin Microbiol， 2003， 41（11）：4915-4923.

[7] Deng J，Zheng Y，Zhao R，et al. Culture versus polymerase chain reaction for the etiologic diagnosis of community-acquired pneumonia in antibiotic-pretreated pediatric patients[J]. Pediatr Infect Dis J，2009，28（1）：53- 55.

[8] Pinar A，Bozdemir N，Kocagz T，et al. Rapid detection of bacterial atypical pneumonia agents by multiplex PCR[J]. Cent Eur J Public Health，2004， 12（1）：3-5.

（收稿日期：2008-12-24）