李明松
貴州安順職院,貴州 安順 561000
【摘 要】:目的:建立地椒草中木犀草素含量測定的HPLC方法;方法: Diamonsil C18(5μm,250×4.6i.d.mm,迪馬公司);流動(dòng)相:甲醇-水-磷酸(60︰40︰0.4);流速:1ml/min;溫度:35℃;檢測波長為350nm;結(jié)果:木犀草素在100.12~800.96ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系,r=0.9999,地椒草藥材平均回收率為97.95%,RSD為0.97%;結(jié)論:HPLC測定地椒草中木犀草素結(jié)果準(zhǔn)確可靠,快速,靈敏,重現(xiàn)性好?
【關(guān)鍵詞】:地椒草;木犀草素;高效液相色譜法;含量測定
【中圖分類號(hào)】R927.2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1007-8517(2009)03(上)0029-02
地椒草Thymus vulgaris[1]為唇形科地椒草屬植物,主要分布于西藏?青海等省,為藏族和蒙古族等民間傳統(tǒng)常用草藥?具有消炎止痛,活血化淤等功效,用于治療跌打損傷,筋骨疼痛,骨質(zhì)松炎等癥[2,3]?主要含有黃酮類[4]?環(huán)烯醚萜類[5]成分?目前尚未見有關(guān)地椒草中指標(biāo)性成分木犀草素含量測定方法的報(bào)道?本文建立了地椒草中木犀草素的HPLC含量測定方法及測定了不同批次藥材中其含量?
1 儀器和材料
高效液相色譜儀:LC-10ATvp泵(美國),SPD-10Avp紫外檢測器(美國),CTO-10Asvp柱溫箱(美國);Shimadzu Libror AEL 40SM(十萬分之一)天平(日本島津所)?
色譜甲醇(天津市科密歐化學(xué)試開發(fā)中心);水(重蒸餾,臨用前制備);木犀草素對(duì)照品(中國生物制品鑒定所,批號(hào):111520-200201)樣品三批(批號(hào):20040101?20040102?20040103)
2 方法與結(jié)果
色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(5μm,250×4.6 i.d.mm,迪馬公司);流動(dòng)相:甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.4);流速:1ml/min;溫度:35℃;檢測波長為350nm?在此條件下,藥材中木犀草素與其他成分能很好地分離?以工作站中的色譜峰純度分析和光譜匹配對(duì)照對(duì)所得色譜圖進(jìn)行分析?結(jié)果地椒草藥材中木犀草素峰的純度角(Purity Angle)為0.846,閾值(Threshold)為1.914;光譜匹配角(Match Angle)為0.384,閾值(Match Threshold)為1.838,在210~400nm范圍內(nèi)與對(duì)照品有很好的光譜匹配?
對(duì)照品溶液的配制 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的木犀草素對(duì)照品適量,加甲醇制成每1ml含木犀草素40μg的溶液,即得?
線性范圍的考察 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的木犀草素對(duì)照品10.12mg置100ml棕色容量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1ml含木犀草素100.12μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液;精密吸取該液2.5?5?10?15?20ml,置25ml棕色容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成每1ml含木犀草素10.012?20.024?40.048?60.072?80.096μg的系列對(duì)照品溶液,分別精密吸取上述系列對(duì)照品溶液各10μl,注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測定峰面積,記錄色譜圖,測定結(jié)果見表1,并以對(duì)照品進(jìn)樣量X(ng)為橫坐標(biāo),峰面積值Y(mv.s)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,木犀草素在100.12~800.96ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?
精密度試驗(yàn)
精密吸取對(duì)照品溶液10μl,重復(fù)進(jìn)樣5次,測定木犀草素峰面積積分值,求出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果表明,木犀草素進(jìn)樣精密度良好,RSD=0.65%?
2.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取地椒草 藥材(批號(hào):20040103)粉末各2g,共5份,按地椒草藥材供試液的制備方法制備供試液?精密吸取供試品溶液各10μl,注入高效液相色譜儀,測定木犀草素峰面積積分值,計(jì)算含量,求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差;結(jié)果表明此方法測定木犀草素的重現(xiàn)性良好,RSD= 1.09%?
2.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取地椒草藥材(批號(hào):20040103)粉末2g,按地椒草 藥材供試液的制備方法制備供試液,在室溫下按表4規(guī)定時(shí)間進(jìn)樣,測定木犀草素峰面積值,求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差;結(jié)果表明,木犀草素在24小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定,RSD=0.84%?
2.3 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn),取已知含量的重現(xiàn)性試驗(yàn)的同一批樣品(批號(hào):20040103,木犀草素平均含量為1.51mg/g)5份,精密稱取各約1g,分別加入木犀草素對(duì)照品溶液(0.3019mg/ml)5ml,按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液,照上述色譜條件,進(jìn)樣?測定,記錄色譜圖,計(jì)算含量,求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,RSD=0.97%,結(jié)果表明,此方法具有較好的加樣回收率,結(jié)果見表1?
2.4 供試品溶液的制備及樣品測定 取本品粉末(過3號(hào)篩)2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入2.5mol/L鹽酸甲醇溶液25ml,稱定重量,于90℃水浴中加熱回流1小時(shí),放冷,再稱定重量,用2.5mol/L鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失重量,搖勻,濾過,精密吸取續(xù)濾液2ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,以微孔濾膜(0.45μm)濾過,即得?
分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μl,注入液相色譜儀,測定,即得?結(jié)果見表2
3 討論
3.1 比較了多種甲醇,水,磷酸比例,最終確定了甲醇-水-磷酸的比例為60∶40∶0.4最為合適,木犀草素的最大吸收波長為349.8nm,故檢測波長選擇了350nm?
3.2 在樣品前處理方法中,比較了甲醇濃度?浸泡時(shí)間和超聲時(shí)間對(duì)木犀草素提取率的影響,最終確定了提取方法?
參考文獻(xiàn)
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(收稿日期:2008.12.2)