劉　學(xué)　單　偉　曾瑞霞　房　艷　李德華　秦書儉

【摘要】 目的 采用針對人端粒酶hTR基因的反義寡聚脫氧核苷酸，探討端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸（antisense oligodeoxy nucleotides,ASODN）對卵巢癌HO-8910細(xì)胞端粒酶活性及細(xì)胞增殖的影響。方法 ①將實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、脂質(zhì)體對照組、端粒酶全硫代正義寡聚脫氧核苷酸（Phosphorathioate sense oligodeoxy nucleotides，PS-SODN）組和不同劑量的全硫代反義寡聚脫氧核苷酸（Phosphorat-hioate antisense oligodeoxy nucleotides，PS-ASODN）組；②脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，PS-ASODN和PS-SODN分別作用于卵巢癌HO-8910細(xì)胞后并培養(yǎng)24、48、72 h，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、吖啶橙染色法、四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT）、流式細(xì)胞術(shù)檢測HO-8910細(xì)胞的端粒酶活性、細(xì)胞形態(tài)、體外增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變。結(jié)果 ①ELISA法檢測結(jié)果顯示端粒酶PS-ASODN作用卵巢癌HO-8910細(xì)胞72 h后端粒酶活性表達(dá)為陰性，說明端粒酶PS-ASODN能夠抑制端粒酶活性；②吖啶橙染色觀察細(xì)胞形態(tài):PS-ASODN作用的卵巢癌HO-8910細(xì)胞有明顯凋亡現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮，說明PS-ASODN能夠促進(jìn)卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡；③MTT實(shí)驗(yàn)：PS-ASODN明顯抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖(P<0.0l )，并呈一定劑量和時(shí)間依賴關(guān)系；④流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和周期：與空白對照組比較，PS-ASODN組G0/G1期細(xì)胞明顯增多，差異顯著（P<0.01）；在G0/G1期前出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，表明細(xì)胞被阻止在G1/S期。結(jié)論 ①PS-ASODN作用于卵巢癌HO-8910細(xì)胞后，卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并出現(xiàn)凋亡；②PS-ASODN對端粒酶活性的抑制率與PS-ASODN的濃度和作用時(shí)間呈依賴關(guān)系，即抑制率隨著反義寡核苷酸的濃度和作用時(shí)間的增加而增大；③以端粒酶RNA模板區(qū)為靶點(diǎn)的PS-ASODN明顯抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是通過降低細(xì)胞的端粒酶活性而誘發(fā)細(xì)胞的凋亡，PS-ASODN對卵巢癌的治療具有重要價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】

端粒酶全硫代反義寡聚脫氧核苷酸；卵巢癌HO-8910細(xì)胞；端粒酶；細(xì)胞凋亡

Effects of telomerase antisense oligodeoxy nucle-otides on HO-8910 ovary carcinoma cell

LIU Xue，SHAN Wei，ZENG Rui-xia，et al.Department of Anatomy，Liao Ning Medical College，Jinzhou 121001，China

【Abstract】 Objective In this study，we apply Oligonucleotide aimed directly at human telomerase RNA（hTR）,To study the effects of telomerase Phosphorathioate antisense oligodeoxy nucleotides (PS-ASODN) on telomerase activity and proliferation of HO-8910 ovary carcinoma cell.Methods ①HO-8910 ovary carcinoma Cell was transfected by PS-ASODN,Phosphorathioate sense oligodeoxy nucleotides（PS-SODN）mediated by Lipotap Liposomal Transfection Reagen.The experiments were classified into normal group、PS-ASODN groups at varied concentrations 、PS-SODN group and oligofectamineTM alone.②The proliferation activity of HO-8910 ovary carcinoma cell line was determined by using methyl thiazolyl tetrazolium assay.The telomerase activity was determined by using enzyme-linked immunosorbent assay.The cell morphology was observed by fluorescence microscope stained with acridine orange.Flow cytometry was adopted to examine apoptotic rate and cell cycle.Results ①With ELISA,Telomerase of HO-8910 ovary carcinoma cell was repressed by telomerase PS-ASODN after 72 h later,it showed that telomerase PS-ASODN could lead inhibition of telomerase activity.②The cell morphology was observed by fluorescence microscope stained with acridine orange：Apoptotic morphological characteristic of HO-8910 ovary carcinoma cell transfected by antisense oligonucleotides was observed.Moreover,the apoptotic cell physical volume contracts.The HO-8910 ovary carcinoma cell growth was inhibited by Phosph-orathioate antisense Oligonucleotide and appeared the apoptosis.③PS-ASODN caused significant (P<0.01) inhibition of cell growth，and the rate of inhibition has the discrepancy between the different dose and different time (P<0.01 and P<0.01).④The apoptotic peak was detected with FCM and cells were stayed in G1/S stage and a sub-Gl stage cell apoptotic peak appear in front of GO/G1 stage（P<0.01）.Typical apoptotic morphologic feature was discovered under light microscope.Conclusion ①The HO-8910 ovary carcinoma cell growth was inhibited by Phosphorathioate antisense Oligonucleotide and appeared the apoptosis.②It showed that the rate of inhibition has the discrepancy between the different dose and different time.In other words，the rate of inhibition enhance along with the augment of the dose and time.③PS-ASODN inhibits strongly the proliferation of HO-8910 ovary carcinoma cell by inhibiting telomerase activity which induce cell apoptosis.PS-ASODN might be a new target to ovary carcinoma therapy.

【Key words】

Telomerase phosphorathioate antisense oligodeoxy nucleotides; HO-8910 ovary carcinoma cell; Telomerase; Cellapoptosis

目前隨著人類生存環(huán)境污染的加劇，生活方式的改變，癌癥已成為威脅人類健康和生命的主要?dú)⑹帧Ｂ殉舶┳鳛槲覈畛Ｒ姷膼盒阅[瘤之一 ［1］。卵巢癌的發(fā)生和進(jìn)展涉及多種癌基因和/或抑癌基因的異常改變以及幾個(gè)遺傳基因的遺傳失穩(wěn)［2］。然而除了這些分子生物學(xué)變化之外，卵巢癌可能還有另外一個(gè)非常重要的生物學(xué)特性，即以細(xì)胞的永生化來維持它的無限生長［3］。研究表明這種永生化的維持主要是依賴腫瘤細(xì)胞中的端粒酶被激活后，使得端粒的長度維持到一定程度，從而使細(xì)胞獲得無限增殖的能力［4］。

端粒（Telomere）是真核細(xì)胞染色體末端含有串聯(lián)重復(fù)的DNA序列,其功能為體細(xì)胞分裂時(shí)端粒的末端會(huì)隨每次的復(fù)制被逐漸縮短，當(dāng)縮短到一定程度不能維持染色體的穩(wěn)定時(shí)細(xì)胞最終死亡。端粒長度保持在延長和縮短的動(dòng)態(tài)平衡中，在這個(gè)平衡體系中端粒酶是關(guān)鍵因素［5］。有關(guān)研究報(bào)告在多種腫瘤細(xì)胞中都可能有端粒酶的活性［6］。端粒酶由蛋白催化亞基和指導(dǎo)端粒合成的RNA模板組成，即為具有逆轉(zhuǎn)錄酶特性的核蛋白酶［7］。端粒酶幾乎在所有惡性腫瘤組織中都有強(qiáng)陽性表達(dá)，而在正常體細(xì)胞及良性腫瘤組織中表達(dá)為陰性［8］，因此端粒酶已成為新的腫瘤標(biāo)志物 ［9］ 。

端粒酶的三個(gè)主要組成成分:端粒酶RNA (human telomerase RNA,hTR )、端粒酶相關(guān)蛋白質(zhì)(telomerase protein 1,TP1/TLP1)及端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase,hTRT/hTERT)己經(jīng)被闡明，基因序列也已經(jīng)被克?。?0］。設(shè)想應(yīng)用反義寡核苷酸封閉該模板區(qū)，就可以抑制端粒酶活性，阻止端粒序列的合成，使細(xì)胞退出增殖周期，達(dá)到治療腫瘤的目的。所以端粒酶不但是特異性惡性腫瘤標(biāo)志物，更是一個(gè)腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一段互補(bǔ)于hTR模板區(qū)（GenBank登陸號為：NR_001566）的反義核酸，用寡核苷酸脂質(zhì)體(OligofectamineTM)介導(dǎo)，將互補(bǔ)于人端粒酶RNA模板區(qū)的反義寡核苷酸作用于體外培養(yǎng)的卵巢癌HO-8910細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫吸附法及流式細(xì)胞學(xué)等技術(shù)觀察反義hTR對卵巢癌HO-8910細(xì)胞端粒酶活性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響,旨在探討端粒酶PS-ASODN在卵巢癌治療中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 人HO-8910卵巢癌細(xì)胞,遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑及藥品達(dá)爾伯克必需基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Deubeccos minimum essential; medium,DMEM）培養(yǎng)基有GIBCO公司生產(chǎn)；小牛血清（fetal bovine serum,FBS）由Hyclone公司生產(chǎn)；胰蛋白酶由Hyclone公司生產(chǎn)；端粒酶全硫代反義寡核苷酸（phosphorathioate antisense oligonucleotide,PS-ASODN）及對照正義全硫代寡核苷酸（phosphorathioate sense oligonucleotide，PS-SODN）均由上海生物工程公司合成。端粒酶PS-ASODN序列為5′-CTCAGTTAGGGTTAGACA-3′；端粒酶PS-SODN序列為5′-TGTCTAACCCTAACTGAG-3′；端粒酶檢測試劑盒由大連泛邦化工技術(shù)有限公司生產(chǎn)。恒溫培養(yǎng)箱由美國Forma Scientific生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀由美國BD公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成 端粒酶全硫代反義寡核苷酸(PS-ASODN)及對照正義全硫代寡核苷酸(PS-SODN):均由上海生物工程公司合成。PS-ASODN序列為5'-CTCAGTTAGGGTTAGACA-3'；PS-SODN序列為5'-TGTCTAACCCTAACTGAG-3'。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組:空白對照(Control)組; 濃度為3 μmol/L的脂質(zhì)體對照組;濃度為3 μmol/L的PS-SODN組; PS-ASODN濃度分別為1、2及 3 μmol/L三個(gè)濃度組。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌HO-8910細(xì)胞以5×10⁴/ml密度接種在含10%新鮮小牛血清、100 U/ml慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置370C、5%CO₂孵箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

（1）細(xì)胞傳代:倒除原培養(yǎng)液，無菌PBS洗滌兩次后加入0.25%的胰蛋白酶0.5 ml消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓時(shí)倒掉胰酶，加入RPMI-1640培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液，以適當(dāng)細(xì)胞密度分裝于幾個(gè)培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（2）復(fù)蘇凍存的細(xì)胞:從-80℃冰箱中取出凍存管，迅速放入37℃水浴箱中搖勻解凍后，在超凈工作臺中，用吸管吸出細(xì)胞懸液裝入離心管，補(bǔ)加10 ml RPMI-1640培養(yǎng)液，混勻后以800轉(zhuǎn)/分離心5 min，倒除上清，加入培養(yǎng)液1 ml吹勻，再移入培養(yǎng)瓶中，如入培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后更換培養(yǎng)液一次，再繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 先將裝有10 OD干膜狀寡聚脫氧核苷酸的EP管離心(10 000 g，10 s)，然后加入550 μl雙蒸水，充分振蕩5 s，配成存儲濃度為100 μmol/L寡聚脫氧核苷酸溶液，之后再對其進(jìn)行稀釋，使其存儲濃度為20 μmol/L以后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求再稀釋(PS-SODN為3 μmo1/L; PS-ASODN為1 、2及3 μmo1/L)。

脂質(zhì)體介導(dǎo)的端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸轉(zhuǎn)染按說明書操作。實(shí)驗(yàn)分6組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。6組分別為終濃度為3、 2及1 μmol/L的PS-ASODN組、終濃度為3 μmol/L的脂質(zhì)體對照組、終濃度為3 μmol/L的PS-SODN組以及空白對照組（僅加培養(yǎng)液）。用藥后將小牛血清的濃度調(diào)至5%，以減少寡聚脫氧核苷酸的降解。24 h后棄去轉(zhuǎn)染液，換新鮮培養(yǎng)液，并繼續(xù)培養(yǎng)，收集細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 ELISA法檢測端粒酶活性 ①細(xì)胞提取物的制備：取處理因素作用后的細(xì)胞5×10⁴，PBS洗滌后離心去上清，加裂解液10 μl，冰浴放置30 min，4℃、1 5000 g離心10 min，取上清液保存于-800C，以備端粒酶活性檢測。按試劑盒說明書操作，檢測每組在450nm處的A值，并計(jì)算相應(yīng)的端粒酶活性；②分組:本實(shí)驗(yàn)按ELISA試劑盒說明書共分為8即：

陰性對照組:陰性反應(yīng)液+酶聯(lián)反應(yīng)物+底物A+底物B+終止液;

陽性對照組:陽性反應(yīng)液+酶聯(lián)反應(yīng)物+底物A+底物B+終止液;

空白對照組:空白反應(yīng)液+酶聯(lián)反應(yīng)物+底物A+底物B+終止液。作用時(shí)間為72 h的不同濃度PS-ASODN檢測組（3、2、1 μmol/L）、脂質(zhì)體對照組(3 μmol/L)和 PS-SODN(3 μmol/L)。各濃度提取物+酶聯(lián)反應(yīng)物+底物A+底物B+終止液;③實(shí)驗(yàn)操作：96孔培養(yǎng)板每組4個(gè)孔重復(fù)3次，(各組的實(shí)驗(yàn)條件都相同只有藥物濃度不同)。待試劑混勻、平衡到室溫（20~25℃）再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

①陽性對照組加入50 μl陽性對照液；陰性對照組加入50 μl陰性對照液；空白對照組加入50 μl空白對照液；各實(shí)驗(yàn)組分別加入50 μl不同濃度藥物的提取物;②8組中每孔都加入50 μl酶聯(lián)反應(yīng)物，輕輕混勻,30 s后用自黏封孔蓋箔封住板孔,37℃溫育60 min;③洗板時(shí)甩盡板內(nèi)液體，8組中每孔內(nèi)分別加入洗滌液350 μl洗滌反應(yīng)板,并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干)，反復(fù)洗滌5次;④8組中每孔依次加入50 μl底物A和50 μl底物B;⑤8組中每孔加100 μl終止液輕輕混勻30 s，30 min內(nèi)在450 nm處讀OD值(再換算成A值)。

結(jié)果判斷：檢測組的A值與空白組的A值之比（index）≥1.00為陽性，在0.91~0.99之間為可疑陽性：≤0.90為陰性。

1.2.3.4 吖啶橙染色法觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)生長期細(xì)胞1×105/ml接種于24孔板中，細(xì)胞接種、轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)方法同上。10 mg吖啶橙溶解于100 ml pH值為6.8的PBS中，4℃避光保存。取轉(zhuǎn)染3 μmol/L PS-ASODN 和3 μmol/L PS-SODN 72 h后的細(xì)胞，按照說明書操作，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3.5 MTT法測定PS-ASODN對卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞以5×10⁴/ml密度接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μl，待細(xì)胞生長活躍時(shí)加處理因素，分組方法與細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法一樣，分別培養(yǎng)24、48、72 h后檢測。檢測方法：每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，翻板倒掉液體，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μl,輕輕振蕩10 min,用自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測 540nm 處的吸光度（A）值。

抑制率=（空白對照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值）/空白對照組平均A值 ×100%

1.2.3.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期 ①PI染色：取對數(shù)生長期細(xì)胞1×105/ml細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種、培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染方法同端粒酶檢測實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞離心收集，PBS洗一次，離心棄PBS，用剩余的PBS充分混勻細(xì)胞，加入預(yù)冷的75%乙醇固定，混勻，用封口膜封口，4℃冰箱過夜。上機(jī)檢測前棄乙醇，PBS清洗細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，加入PI(50 μg/ml) 800 μl混勻，4℃避光染色1 h,300目尼龍網(wǎng)濾過，上機(jī)檢測，進(jìn)行DNA含量、細(xì)胞周期的分析，低于G1期DNA含量主峰(亞G1期峰)的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；②AnnexinV-FITC/PI染色:將各組細(xì)胞用胰酶消化，再用PBS洗滌，調(diào)整待測細(xì)胞的濃度為1×106個(gè)/ml。取1 ml細(xì)胞，1000 g，4℃離心10 min，棄上清；用PBS洗3次后將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer；加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min；加入300 μl Binding Buffer，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，用SPSS 11.5軟件包處理，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PS-ASODN對卵巢癌HO-8910細(xì)胞端粒酶活性的影響 檢測72 h各組端粒酶活性陰陽性結(jié)果表明：3.0 μmol/L的PS-SODN和3.0 μmol/L脂質(zhì)體對照組的端粒酶活性表現(xiàn)均為陽性；而濃度分別為1、2、3 μmol/L的PS-ASODN組端粒酶活性表現(xiàn)均為陰性，表明PS-SODN和脂質(zhì)體對卵巢癌HO-8910細(xì)胞端粒酶活性無影響，而PS-ASODN 對卵巢癌HO-8910細(xì)胞端粒酶活性有抑制作用(見表1)。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 吖啶橙染色72 h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞漿豐富，胞核及分裂正常(見圖 1) ；PS-ASODN組卵巢癌HO-8910細(xì)胞體積縮小，核皺縮并有細(xì)胞膜出芽，有明顯凋亡現(xiàn)象，表明PS-ASODN具有促進(jìn)卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡的作用(見圖 2)。

2.3 PS-ASODN對卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖的影響 與空白對照組比較,正義寡聚脫氧核苷酸組和脂質(zhì)體組細(xì)胞增殖不顯著(P>0.05)；濃度分別為1、2、3 μmol/L反義寡聚脫氧核苷酸組均能顯著抑制細(xì)胞增殖(P<0.05) 并呈一定的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系（見表2）。

抑制率的計(jì)算結(jié)果表明，PS-ASODN各濃度組差異顯著(P<0.05)，并呈一定的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，即抑制率隨著PS-ASODN的作用時(shí)間和劑量的增加而增大（見表3）。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 與空白對照組比較，濃度分別為1.0、2.0、3.0 μmol/L的PS-ASODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，G₀/G₁期細(xì)胞明顯增多，差異顯著（P<0.01）（見表4），在G0/G1期前出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰（見圖3、4、5、6），表明細(xì)胞被阻止在G1/S期。

在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，轉(zhuǎn)染72 h后空白對照組活細(xì)胞數(shù)量占73.57%，凋亡細(xì)胞數(shù)量占9.11%；濃度為3.0 μmol/L PS-ASODN組活細(xì)胞數(shù)量占39.50%，凋亡細(xì)胞數(shù)量占35.26%。表明PS-ASODN 能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡(見圖9、圖10 )。

3 討論

端粒是真核線形染色體末端結(jié)構(gòu)，由端粒DNA和端粒結(jié)合蛋白組成。它由一端高度保守的重復(fù)序列(TTAGGG ) n組成，方向5＇→3＇，長度約5~15 kb［11］，端粒長度的維持需要端粒酶的激活。自身攜帶模板是端粒酶區(qū)別于一般的純蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶的主要特征之一。

端粒酶調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂及細(xì)胞的壽命，參與細(xì)胞增殖、分化、衰老等活動(dòng)，尤其與細(xì)胞的癌變密切相關(guān)，在正常人胚胎組織中，未分化的神經(jīng)上皮細(xì)胞中有最高的hTR表達(dá)，大多數(shù)分化高的組織其表達(dá)缺乏或降低。成人組織中，睪丸細(xì)胞hTR高表達(dá)，淋巴小結(jié)中度表達(dá)，上皮細(xì)胞微弱表達(dá)，而且只限于特定的有絲分裂期細(xì)胞，神經(jīng)系統(tǒng)和間質(zhì)來源細(xì)胞無表達(dá)［12］。 1995年Feng［13］首次克隆了人端粒酶RNA (hTR)組分，發(fā)現(xiàn)反義或突變的RNA結(jié)構(gòu)都可能影響端粒酶的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

國外學(xué)者［14］對乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、食管癌等進(jìn)行廣泛深入研究。研究證實(shí)反義寡聚脫氧核苷酸對癌細(xì)胞的端粒酶活性和細(xì)胞增殖均起到了抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞周期改變和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。其作用機(jī)制是:特定反義核酸分子與進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的mRNA上的特異位點(diǎn)雜交，形成DNA-RNA復(fù)合物，抑制mRNA與核糖體的結(jié)合，同時(shí)激活RNase H,RNase H能使mRNA降解，從而使特定的基因不能表達(dá)，相應(yīng)的蛋白質(zhì)合成受到抑制［15］ 。但尚未發(fā)現(xiàn)反義寡聚脫氧核苷酸能對卵巢癌HO-8910細(xì)胞起同樣作用的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用反義hTR轉(zhuǎn)染卵巢癌HO-8910細(xì)胞，為減少細(xì)胞對反義核酸的降解作用并增加其入胞效率，采用全硫代磷酸修飾其分子。 其中PS-ASODN是根據(jù)靶基因序列，以堿基互補(bǔ)配對方式設(shè)計(jì)而成，因此進(jìn)入細(xì)胞后只能作用于靶基因，而不與非相關(guān)基因作用，故針對性強(qiáng)，特異性高且片段短，可以完全被細(xì)胞吸收進(jìn)入細(xì)胞核，經(jīng)硫代修飾后具有很強(qiáng)的抗核酶能力，再經(jīng)寡聚脫氧核苷酸脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入卵巢癌HO-8910細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示反義寡聚脫氧核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖明顯受到抑制、端粒酶活性明顯降低，與空白對照組、脂質(zhì)體組、正義寡聚脫氧核苷酸組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01)，表明反義寡聚脫氧核苷酸是良好的端粒酶抑制劑。

另有研究結(jié)果表明，端粒酶活性與細(xì)胞增殖有關(guān)，因此，端粒酶抑制劑抑制了細(xì)胞端粒酶活性，自然也使其增殖受到抑制［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸抑制端粒酶活性，同時(shí)也抑制了細(xì)胞增殖。

Zhu等［17］研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性是細(xì)胞周期依賴性調(diào)控。端粒酶在DNA復(fù)制期激活，以保持端粒延長，因此，在細(xì)胞周期中，端粒酶活性經(jīng)G1/S期逐漸升高，S期最高，G2/M最低，G₀/G₁期幾乎處于靜止期。

本研究FCM檢測提示:72 h后空白對照組細(xì)胞增殖旺盛，S期細(xì)胞占細(xì)胞周期的23.26%,但凋亡率為9.03%。PS-SODN處理組凋亡率僅為10.63%，兩者差異無顯著性(P>0.05)。而相同條件下PS-ASODN組FC-M檢測發(fā)現(xiàn)能阻止HO-8910細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，使S期細(xì)胞明顯減少，降為5.47%,凋亡率為35.26%,表明細(xì)胞分裂增殖活動(dòng)減弱，細(xì)胞被阻止在G1/S期。細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞的DNA裂解，在流式細(xì)胞儀上呈現(xiàn)亞二倍體凋亡峰。表明反義寡聚脫氧核苷酸能夠誘導(dǎo)卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡并促使細(xì)胞周期發(fā)生改變。根據(jù)FCM檢測結(jié)果推測PS-ASODN可能通過與端粒酶RNA模板的特異性結(jié)合而阻斷其表達(dá)，從而有效地抑制S期端粒酶活性，端粒合成受到抑制，使染色體末端不穩(wěn)定,腫瘤細(xì)胞阻滯于M₂期，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)監(jiān)控功能增強(qiáng)，激活了凋亡相關(guān)基因啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。

一些學(xué)者認(rèn)為［18-20］，端粒酶抑制劑對細(xì)胞的增殖抑制可能與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。而端粒酶抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能通過兩條途徑:①端粒酶活性被抑制導(dǎo)致端粒延伸障礙，端粒長度不能維持，當(dāng)細(xì)胞分裂導(dǎo)致端粒縮短到一定程度，通過p53等凋亡調(diào)節(jié)蛋白［21］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；②端粒酶活性被抑制導(dǎo)致一些已經(jīng)處于極短的端粒不能維持功能，細(xì)胞染色體發(fā)生斷裂、融合、DNA破壞，觸發(fā)細(xì)胞凋亡［22］。本實(shí)驗(yàn)用吖啶橙染色轉(zhuǎn)染反義核酸的卵巢癌HO-8910細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可見，卵巢癌HO-8910細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜出芽，細(xì)胞核皺縮、碎裂、凋亡小體等明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：（1）互補(bǔ)于hTR模板區(qū)的反義寡聚脫氧核苷酸明顯抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖及端粒酶活性，作用方式呈時(shí)間和劑量依賴性，即隨著反義寡聚脫氧核苷酸濃度加大和培養(yǎng)時(shí)間延長，抑制作用逐漸增強(qiáng)。這主要是由于反義寡聚脫氧核苷酸封閉了hTR模板區(qū)，阻止了端粒酶合成端粒，從而有效地抑制了卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖；（2）反義寡聚脫氧核苷酸轉(zhuǎn)染卵巢癌HO-8910細(xì)胞后，端粒酶活性顯著下降。筆者認(rèn)為，很可能反義寡聚脫氧核苷酸本身不一定具有調(diào)節(jié)凋亡的作用，其對凋亡的調(diào)節(jié)可能是通過改變端粒長度所致，因?yàn)槎肆ｉL度的維持、染色體的穩(wěn)定是凋亡的一個(gè)抑制因素，而端粒的縮短可觸發(fā)細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果說明反義寡聚脫氧核苷酸能夠通過抑制hTR基因的表達(dá)，抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞端粒酶活性，從而達(dá)到抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖。這也為卵巢癌基因治療提供了新的靶點(diǎn)，結(jié)合其他治療方法有望提高卵巢癌基因治療的成功率。

盡管端粒酶在幾乎所有惡性腫瘤都有強(qiáng)陽性表達(dá)，而且反義hTR寡核苷酸制劑由于特異性封閉hTR模板區(qū)而抑制了端粒酶活性，在腫瘤的治療方面顯示出巨大的潛力。但對端粒酶陽性的生殖細(xì)胞和干細(xì)胞所帶來的后果不得不引起我們的關(guān)注，尤其是生殖細(xì)胞，如果針對腫瘤細(xì)胞的端粒酶抑制劑同樣可以進(jìn)入人生殖細(xì)胞，使其端粒酶失活，后果將是一個(gè)種屬的滅絕;但也有人持不同的觀點(diǎn)，認(rèn)為正常細(xì)胞的端粒較多數(shù)腫瘤細(xì)胞的長，并且原始干細(xì)胞較少進(jìn)行有絲分裂，其端?？s短的速度遠(yuǎn)低于腫瘤細(xì)胞，因此端粒酶抑制劑的療程可在正常細(xì)胞的端粒酶耗盡前停止，當(dāng)抑制端粒酶治療結(jié)束后，正常細(xì)胞的端粒酶活性可得到修復(fù)。此外部分腫瘤細(xì)胞具有較長的端粒，而隨細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行，端粒的縮短是一個(gè)緩慢的過程，在這種情況下端粒酶抑制劑是否有效，尚待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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