周　林　韓金星　黃金艷　覃斯華　李文信　洪日新　何　毅　李天艷　樊學(xué)軍

摘要：概述了當(dāng)前國(guó)內(nèi)外葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)過程中的主要影響因素，總結(jié)了單倍體植株的倍性鑒定方法與染色體加倍技術(shù)，探討了目前存在的問題以及今后的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：葫蘆科蔬菜；花藥培養(yǎng)；單倍體；倍性鑒定；加倍

葫蘆科(Cucurbitaccac)蔬菜在我國(guó)常見的主要包括西瓜、甜瓜、苦瓜、黃瓜、西葫蘆等，栽培面積大，且具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，在百姓日常生活中具有重要作用。但由于我國(guó)地域遼闊，氣候因素和地理環(huán)境因素等生態(tài)因子限制了優(yōu)良品種優(yōu)良特性的發(fā)揮，通過簡(jiǎn)單的引種已經(jīng)不能適應(yīng)各地生產(chǎn)的需要。而通過常規(guī)育種手段進(jìn)行品種改良又存在周期比較長(zhǎng)、難度大、遺傳性狀不穩(wěn)定等諸多問題，因此利用生物技術(shù)手段育種則是另一條重要途徑。葫蘆科蔬菜的花藥培養(yǎng)技術(shù)不僅能夠縮短育種過程中選擇及純化的時(shí)間，而且對(duì)遺傳育種具有重要的理論和實(shí)際意義。

利用葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的歷史可追溯到1971年西貞夫等對(duì)黃瓜花藥培養(yǎng)進(jìn)行的研究，他們獲得了不定芽。在隨后的幾十年里，研究者們?cè)诤J科蔬菜9個(gè)屬中的南瓜屬、葫蘆屬、西瓜屬、甜瓜屬和苦瓜屬等5個(gè)屬獲得了單倍體。

1影響葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的主要因素

影響花藥培養(yǎng)的因素很多，涉及到供體植株的基因型、小孢子發(fā)育時(shí)期等內(nèi)部因素和培養(yǎng)基成分、激素、碳源以及培養(yǎng)條件等外部因素，并且這些因素之間還存在著一定的互作效應(yīng)。

1.1材料

1.1.1基因型材料基因型對(duì)花藥培養(yǎng)的影響主要表現(xiàn)在對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的不同上，即使在同一種內(nèi)，同一方法、不同材料間有顯著的差別。在葫蘆科蔬菜中，研究者就此對(duì)西瓜、甜瓜、黃瓜等進(jìn)行了不同程度的研究，其中以西瓜花藥培養(yǎng)技術(shù)較為成功，前人研究較多，認(rèn)為不同品種基因型之間愈傷組織誘導(dǎo)率相差很大，選擇適合誘導(dǎo)品種是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。在李娟等的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，野生品種和栽培品種的愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著差別，前者要高于后者。另有研究表明，F(xiàn)1代在花藥培養(yǎng)中的愈傷組織產(chǎn)量高于或至少等于其高產(chǎn)量親本，有個(gè)別組合的F1代愈傷組織產(chǎn)量甚至成倍地高于其高產(chǎn)量親本，表現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)。在緱艷霞的西瓜花藥培養(yǎng)試驗(yàn)和董艷榮的甜瓜花藥培養(yǎng)試驗(yàn)中對(duì)此也進(jìn)行了證明，

1.1.2小孢子發(fā)育時(shí)期小孢子細(xì)胞發(fā)育時(shí)期一般分為四分體時(shí)期、小孢子時(shí)期(單核早期、單核中期、單核靠邊期、雙核期)和成熟花粉粒時(shí)期。不同植物花藥培養(yǎng)最適宜的小孢子發(fā)育時(shí)期不同，而最適發(fā)育時(shí)期是影響誘導(dǎo)效果的關(guān)鍵。有研究表明，南瓜小孢子單核中期和單核晚期效果較好，接種在MS+15％蔗糖+5mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基上能夠誘導(dǎo)出具分化能力的愈傷組織。另有文獻(xiàn)指出，甜瓜花藥培養(yǎng)最佳時(shí)期是單核靠邊期到雙核期，黃瓜以單核中后期的小孢子為佳，總體來說，大部分集中在小孢子時(shí)期，即單核早期到雙核期，通常以外部形態(tài)指標(biāo)如花辦長(zhǎng)/花藥長(zhǎng)或花蕾長(zhǎng)度作為此期的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2培養(yǎng)基成分

1.2.1基本培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)常用培養(yǎng)基有MS、Nitsch、White和N₆等，培養(yǎng)基的成分、種類、濃度不同，都會(huì)影響花藥培養(yǎng)的效果，以MS培養(yǎng)基的使用最為普遍。薛光榮袁萬良、魏瑛等在西瓜花藥培養(yǎng)中都用MS作為基本培養(yǎng)基，且效果較好。陳佳在苦瓜花藥培養(yǎng)中比較了MS、N₆3N種基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)L培養(yǎng)基不適合苦瓜花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。

1.2.2碳源糖是培養(yǎng)基內(nèi)的碳源，起到為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源和調(diào)節(jié)滲透壓的作用，糖的類型和濃度影響著胚胎形成，蔗糖作為眾多碳源類型中在葫蘆科花藥培養(yǎng)使用較多且效果較好的碳源，適宜濃度為3％～6％。蔗糖經(jīng)高壓滅菌后分解為果糖和葡萄糖，因此也常作為碳源另外添加，麥芽糖等其他碳源已用于小麥作物的花藥培養(yǎng)中，但在葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)上應(yīng)用還不多，陳佳在苦瓜花藥培養(yǎng)中對(duì)培養(yǎng)基添加麥芽糖進(jìn)行了試驗(yàn)，認(rèn)為其所誘導(dǎo)出的愈傷組織胚性高低需進(jìn)一步研究。

1.2.3激素激素對(duì)花藥培養(yǎng)中誘導(dǎo)花藥胚狀體的發(fā)生起到了關(guān)鍵作用，主要包括了生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，前者常用的包括2.4-D，IAA，NAA等，后者常用的包括KT和6-BA等。一般來說，低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素可以提高胚狀體的誘導(dǎo)率，其中2，4-D在西瓜愈傷組織誘導(dǎo)過程中不宜超過0.5mg/L，否則易產(chǎn)生沒有分化能力的疏松愈傷組織；而低質(zhì)量濃度2.4-D(0.4 mg/L)可以使甜瓜花藥愈傷組織內(nèi)部產(chǎn)生細(xì)胞核較大的胚性細(xì)胞、二細(xì)胞團(tuán)和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。同時(shí)，6-BA與生長(zhǎng)素的配合使用也起到了關(guān)鍵作用。對(duì)愈傷組織和胚狀體的分化，6-BA也起到了重要的作用，配合適當(dāng)質(zhì)量濃度的IAA可分化出小植株。

1.2.4其他添加成分活性炭(AC)常被作為防止褐化的抗氧化劑物質(zhì)添加到花藥培養(yǎng)基中，在有關(guān)辣椒花藥培養(yǎng)中，有試驗(yàn)表明添加0.5％的活性炭是有益的。而在葫蘆科蔬菜上，喻財(cái)鈴和緱艷霞分別在絲瓜和西瓜的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加入活性炭的效果差，有抑制作用。

大多數(shù)研究認(rèn)為，硝酸銀作為乙烯抑制劑，在組織及細(xì)胞培養(yǎng)中能夠促進(jìn)胚性愈傷組織的形成；也有人認(rèn)為它能促進(jìn)多胺的合成以提高胚性愈傷組織的形成，進(jìn)而提高愈傷組織分化頻率。在小麥花藥愈傷組織分化培養(yǎng)基中加入硝酸銀有利于提高愈傷組織分化率和綠苗率，可提高小麥花藥培養(yǎng)效率。在葫蘆科蔬菜的花藥培養(yǎng)中應(yīng)用硝酸銀少見報(bào)道，曹利仙等發(fā)現(xiàn)黃瓜離體子葉培養(yǎng)中添加2～6 mg/L硝酸銀能顯著提高子葉芽的再生頻率，韓麗華將硝酸銀應(yīng)用于厚皮甜瓜未受精胚珠的離體培養(yǎng)上，發(fā)現(xiàn)對(duì)誘導(dǎo)單倍體再生植株有一定的作用。

三十烷醇作為外源添加劑最先在袁萬良等報(bào)道的西瓜花藥培養(yǎng)中使用，發(fā)現(xiàn)可以提高綠色愈傷組織的誘導(dǎo)率，并形成深綠色點(diǎn)狀組織，提高了再生植株的誘導(dǎo)率。隨后在李娟等的西瓜花藥培養(yǎng)試驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)三十烷醇有此作用，但在緱艷霞和王開凍等的西瓜花藥培養(yǎng)試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)三十烷醇只對(duì)誘導(dǎo)和保持綠色愈傷組織有利，對(duì)促進(jìn)不定芽形成作用不明顯，而三十烷醇在其他葫蘆科蔬菜上的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1預(yù)處理花藥或花粉經(jīng)過預(yù)處理后再進(jìn)行培養(yǎng)是花藥培養(yǎng)中比較常見的培養(yǎng)方法，其中包括低溫、高溫、熱激以及離心。大部分葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)采用低溫對(duì)花藥進(jìn)行預(yù)處理，其作用是：第1，引起花藥內(nèi)源激素發(fā)生變化，進(jìn)而影響愈傷組織的形成；第2，引起小孢子的孤立化，使花藥壁細(xì)胞和絨氈層在低溫預(yù)處理過程中退化解體：第3，減緩小孢子退化，保持生活力，使更多的小孢子有機(jī)會(huì)參與雄核發(fā)育。魏瑛的研究表明西瓜花藥在4℃下低溫處理72 h效果較佳：Ashok Kumar等將黃瓜花蕾在4、32℃下分別處理1～10d、1d，結(jié)果表明在4℃下處理2d的效果最佳。

1.3.2培養(yǎng)溫度及光照花藥培養(yǎng)中，培養(yǎng)溫度和光照

對(duì)愈傷組織或胚狀體的形成以及促進(jìn)其生長(zhǎng)都有重要作用。大部分葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的溫度為25～28℃，在西瓜花藥培養(yǎng)中，緱艷霞嘗試了將花藥在30℃下高溫預(yù)處理72 h后置于25℃低溫下，發(fā)現(xiàn)也能提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。先黑暗培養(yǎng)后光照培養(yǎng)，也能促進(jìn)優(yōu)良愈傷組織的誘導(dǎo)。這在甜瓜、絲瓜上都得到了驗(yàn)證。

2葫蘆科蔬菜單倍體倍性鑒定及加倍技術(shù)

通過花藥培養(yǎng)途徑再生的植株，往往會(huì)受到花藥壁、絨氈層組織等的影響產(chǎn)生單倍體、二倍體及其他倍性植株的混合群體。因此，有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前的倍性鑒定方法主要有直接鑒定法和間接鑒定法。

2.1直接鑒定法

直接鑒定法即染色體計(jì)數(shù)方法，這是確定倍性最基本和最精確的方法，傳統(tǒng)采用根尖、卷須、葉片愈傷組織為材料，常采用壓片法和去壁低滲法進(jìn)行染色體標(biāo)本制備。其中壓片法先在對(duì)二氯甲苯或8－羥基喹啉水溶液預(yù)處理，使中期染色體縮短。再用卡諾固定液固定1～2h，最后以醋酸洋紅或鐵礬蘇木精作為染色劑，觀察細(xì)胞中期染色體并計(jì)數(shù)。在鑒定單倍體根尖細(xì)胞染色體數(shù)目時(shí)，由于單倍體植株根尖具有二倍化的傾向，也就是細(xì)胞中染色體組可能自然加倍，因此僅進(jìn)行根尖分析，還不能為植物的染色體提供可靠的證據(jù)，應(yīng)輔助根尖以外的細(xì)胞如嫩葉細(xì)胞、花粉母細(xì)胞等的染色體觀察也是必要的，這樣可以排除嵌合體的干擾。去壁低滲法是陳瑞陽在國(guó)內(nèi)首創(chuàng)的染色體標(biāo)本制備方法，該方法既可用于染色體計(jì)數(shù)，還可用于染色體組型分析Gimsa分帶等研究，并可借助掃描電鏡對(duì)植物染色體進(jìn)行觀察。

2.2間接鑒定法

間接鑒定法主要包括外部形態(tài)指標(biāo)鑒定、葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)目鑒定以及流式細(xì)胞儀鑒定法。杜勝利等通過研究比較黃瓜輻射花粉授粉產(chǎn)生的再生植株中的二倍體和單倍體，發(fā)現(xiàn)單倍體植株較之二倍體植株具有葉片小、花辦裂片深、長(zhǎng)勢(shì)弱等特點(diǎn)。且不能正常結(jié)籽，雄花敗育，雌雄花花冠明顯深裂，可以作為區(qū)分黃瓜單倍體和二倍體植株的形態(tài)指標(biāo)。在顯微鏡下觀察葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度，是近年來采用較多的倍性鑒定方法，通過卡方適應(yīng)性測(cè)定表明，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度在單倍體與二倍體之間存在著真實(shí)差異。Sail等在西瓜、Norio和馬國(guó)斌等在甜瓜上均發(fā)現(xiàn)葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體個(gè)數(shù)與植物倍性呈正相關(guān)，可以作為鑒定西瓜、甜瓜倍性的間接方法。流式細(xì)胞儀通過測(cè)定處于分裂間期細(xì)胞DNA含量，從而確定細(xì)胞的倍性，是一種快速的鑒定方法。且不受取樣部位和時(shí)間限制，對(duì)樣品的需要量少，適合大量樣本檢測(cè)使用，但檢測(cè)成本較高，應(yīng)用范圍有限。

2.3染色體加倍技術(shù)

利用離體培養(yǎng)過程中染色體自然加倍現(xiàn)象得到二倍體純合植株是目前花藥培養(yǎng)育種最為常見的加倍方法，但受到多種因素影響。其中物種的影響最大，如自然加倍率水稻花藥培養(yǎng)為70％，煙草花藥培養(yǎng)幾乎為0，小麥花藥培養(yǎng)在20％～30％。而葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)再生植株自然加倍率也很低，僅在西瓜上有過報(bào)道。有研究表明花藥培養(yǎng)再生植株自然加倍主要是通過核內(nèi)有絲分裂進(jìn)行，這和接種花藥的發(fā)育時(shí)期，培養(yǎng)基中激素的種類和水平，花粉植株的發(fā)生方式以及愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)系。

染色體人工加倍最有效的方法是采用藥劑處理，常用藥劑除了秋水仙素，還有一些有機(jī)殺菌藥劑。通常使用秋水仙素0.1％～0.5％溶液處理離體培養(yǎng)的單倍體植株腋芽、頂芽或整個(gè)植株。Sail等用0.5％秋水仙堿浸泡單倍體幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)也成功地使西瓜單倍體加倍得到雙單倍體植株。

3問題與展望

就目前而言，大部分葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的研究主要集中在西瓜、甜瓜、黃瓜3個(gè)種類上，而對(duì)南瓜、苦瓜等其他物種研究較少。在多數(shù)葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)獲得的再生植株是通過愈傷組織途徑得到的，而細(xì)胞愈傷化后極不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生多倍體和非整倍體。并且花藥愈傷組織可能來自小孢子，也有可能來自花藥壁等體細(xì)胞，在愈傷組織階段很難鑒別其倍性。另外在花藥培養(yǎng)離體再生的過程中，由于受到各種內(nèi)、外部因素的影響，愈傷組織容易褐化、分化難、芽伸長(zhǎng)緩慢、再生頻率低，并且再生體系重復(fù)性差。而通過胚狀體途徑得到的再生植株可以減少來自花藥壁等體細(xì)胞的再生植株，同時(shí)胚狀體的成苗率和再生植株的成活率都比較高，并且能自然加倍成為二倍體純合植株。因此，深入研究小孢子脫分化啟動(dòng)與胚狀體的發(fā)生機(jī)理和誘導(dǎo)條件是從胚狀體途徑提高葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率的關(guān)鍵。葫蘆科蔬菜的自然加倍率較低，而通過秋水仙素處理的人工加倍，整體加倍效率不高，且易產(chǎn)生多倍體，人為控制的因素和方法需要進(jìn)一步的探討。雖然對(duì)葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的研究已取得了一定的進(jìn)展，但存在的問題還很多。在今后的研究中，高頻再生體系的建立和成熟的加倍技術(shù)仍是我們研究的重點(diǎn)，從而在此基礎(chǔ)上達(dá)到創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，提高葫蘆科蔬菜育種水平的目的。