陳　江　李建蓉　陳任生　何星星

[摘要]目的 探討MDM2在結(jié)腸黏膜癌變過(guò)程中的表達(dá)和意義。方法 應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)MDM2在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸腺癌中的表達(dá)。結(jié)果 DM2在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率逐步升高,分別為10%(2/20)、81.8%(18/22)、98.5%(65/66),組間比較差異均有顯著性 (P<0.05)。MDM2的表達(dá)強(qiáng)度和結(jié)腸腺癌的分化程度無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 DM2參與結(jié)腸黏膜向癌組織演變的過(guò)程,并在早期發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]MDM2;結(jié)腸腺瘤;結(jié)腸腺癌

[中圖分類(lèi)號(hào)]R735.3+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)]1004-8650(2009)10-04-03

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤,近年來(lái)其發(fā)病率有增加趨勢(shì)。結(jié)腸腺瘤是癌前病變,和結(jié)腸癌發(fā)生密切相關(guān)。目前認(rèn)為,正常結(jié)腸黏膜-結(jié)腸腺瘤-結(jié)腸癌這一演變過(guò)程,是由癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)積累導(dǎo)致的。MDM2是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的癌基因,和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),本研究用免疫組化的方法檢測(cè)MDM2在結(jié)腸黏膜癌變過(guò)程中的表達(dá),旨在探討結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本:來(lái)源于2007年1月-2008年9月期間南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)及結(jié)腸鏡活檢的組織,經(jīng)100ml/ L 福爾馬林固定,石蠟包埋,4μm 厚連續(xù)切片,并經(jīng)HE染色病理診斷證實(shí)。總共108例標(biāo)本,正常結(jié)腸黏膜20例,腺瘤22例,腺癌66例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:兔抗人突變型p53單克隆抗體、鼠抗人MDM2單克隆抗體、鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、DAB顯色試劑盒和PV-9000試劑盒均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 主要儀器:DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海);Leica RM-2135型石蠟切片機(jī)(德國(guó));Nikon 55i 電子數(shù)碼顯微鏡(日本)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)MDM2的步驟:免疫組化染色按PV-9000試劑盒(購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司) 操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所有蠟塊制成厚4μm 的切片,切片脫蠟至水,充分洗滌后,置枸櫞酸修復(fù)液中,微波修復(fù)15 min。MDM2工作液濃度為1∶100,Ⅰ抗孵育時(shí)4 ℃過(guò)夜,Ⅱ、Ⅲ抗孵育時(shí)37 ℃溫箱內(nèi)各20min,DAB 顯色。試驗(yàn)設(shè)已知陽(yáng)性、陰性對(duì)照及PBS代替一抗為空白對(duì)照,作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定:MDM2陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核,部分出現(xiàn)在胞漿中。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Fromowitz陽(yáng)性細(xì)胞半定量分級(jí)法。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),得出陽(yáng)性細(xì)胞百分率。先根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)計(jì)分:≤5%者為0分,6%-25%者為1分,26%-50%者為2分,>50%者為3分;再根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;然后根據(jù)兩者相乘所得的總分進(jìn)行結(jié)果判定:0分為陰性“-”,1-2分為弱陽(yáng)性“+”,3-4分為中度陽(yáng)性“++”,6-9分為強(qiáng)陽(yáng)性“+++”。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法:采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料采用方差分析,組間率的比較采用χ2檢驗(yàn),MDM2表達(dá)強(qiáng)度比較采用秩和檢驗(yàn),結(jié)腸腺癌中MDM2的表達(dá)強(qiáng)度和腺癌分級(jí)的相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)選α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MDM2在各組織中的表達(dá)

總共108例標(biāo)本,正常結(jié)腸黏膜20例,腺瘤22例,腺癌66例,三組間的年齡、性別無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。MDM2的陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)表1)分別為:正常結(jié)腸黏膜組2例(10%),腺瘤組18例(81.8%),腺癌組65例(98.5%),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 結(jié)腸腺癌的分化程度和MDM2表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系

66例腺癌中,能明確分級(jí)的有41例,其中高分化腺癌級(jí)10例,中分化腺癌21例,低分化腺癌10例,行腺癌分級(jí)和MDM2表達(dá)強(qiáng)度+,++,+++的等級(jí)相關(guān)分析,結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤,在我國(guó)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1],結(jié)腸癌被認(rèn)為大多起源于腺瘤。正常結(jié)腸黏膜在各種損傷因素的影響下,使抑制細(xì)胞增殖的抑癌基因失活,或使刺激細(xì)胞增殖的原癌基因激活,導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)度和失去分化,引起結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有學(xué)者提出了大腸腺瘤—腺癌序列的分子發(fā)病模式[2,3]。MDM2 (murine double munite2 ,MDM2) 為小鼠雙微體基因,是近年發(fā)現(xiàn)的一種癌基因,MDM2蛋白對(duì)野生型p53具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能,介導(dǎo)p53降解和抑制p53轉(zhuǎn)錄活性;而MDM2的表達(dá)水平又受野生型p53的調(diào)節(jié),當(dāng)野生型p53水平增高時(shí),便可激活MDM2基因轉(zhuǎn)錄并表達(dá);如此,野生型p53和MDM2之間形成了一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán),在維持野生型p53的正常生理功能方面具有重要作用[4]。MDM2除抑制抑癌基因p53產(chǎn)生,其本身也有致癌作用。有關(guān)MDM2在結(jié)腸腺瘤中的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果,各家報(bào)道不一致[5,6]。我們的研究顯示,在正常結(jié)腸黏膜中,MDM2的表達(dá)基本為陰性,而在腺瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為81.8%,有顯著性差異,說(shuō)明在結(jié)腸癌前病變中,MDM2即發(fā)揮作用。MDM2在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)率高達(dá)98.5%,其表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于腺瘤和正常結(jié)腸黏膜。我們進(jìn)一步分析了結(jié)腸腺癌分級(jí)和MDM2表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系,結(jié)果表明,在結(jié)腸腺癌的低分化、中分化和高分化分級(jí)中,其MDM2的表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著性差異。這和其他研究結(jié)果相一致[7,8]。這說(shuō)明MDM2參與了結(jié)腸黏膜癌變的過(guò)程,在結(jié)腸癌的始發(fā)和早期形成發(fā)展中起重要作用,而在結(jié)腸癌的分化中無(wú)明顯作用。

本研究由于標(biāo)本資料等限制,未探討MDM2的表達(dá)同結(jié)腸癌的分期和轉(zhuǎn)移的關(guān)系,還有待于進(jìn)一步研究。

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(收稿日期2009-06-29)