徐 海

[摘要] 目的 研究帕金森病(Parkinsons disease ,PD) 大鼠黑質(zhì)區(qū)pitx3 基因的表達(dá)情況。方法將6-OHDA注入紋狀體內(nèi)制作PD大鼠模型,于不同時(shí)間點(diǎn)處死,觀察pitx3基因的表達(dá)情況。結(jié)果同正常組、假手術(shù)組比較,PD模型大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)區(qū)的pitx3基因在模型成功后第一周表達(dá)明顯下降,15天后少量增加,30天后也未恢復(fù)到正常水平。結(jié)論6-OHDA紋狀體內(nèi)注射制作的PD大鼠模型中腦黑質(zhì)區(qū)pitx3的表達(dá)明顯下降與DA能神經(jīng)元的死亡直接相關(guān),2周后pitx3表達(dá)增加可能與自體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 帕金森病; 黑質(zhì)區(qū);pitx3

[中圖分類號(hào)] R742 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1004-8650(2009)06-019-02

The gene expression of Pitx3 in substantia nigra of rat model of Parkinsons disease

XU Hai

[Abstract] Objective To explore the gene expression of Pitx3 in substantia nigra of rat model of Parkinsons disease. Methods Rat model of Parkinsons disease was made by injecting the 6-hydroxydopaminin(6-OHDA)in the striatum. The rats were killed at different time points, and their brains were taken out. Using the methods of immunofluorescence, we deteded the gene expression of Pitx3 in substantia nigra of hemi-parkinsonian rats. Results Campared with the controls, the number of pitx3-positive cells was significantly decreased in the first week after PD models were set up, however, there was also a slight increase of pitx3-positive cells 15 days after and no further increase 30 days after. Conclusion The decreasing expression of Pitx3 in substantia nigra of PD rat model is probably related to the apoptosis of the dopaminergic neurons. Furthermore, the augmentation of pitx3 gene expression 15 days after may be associated with the proliferation and differentiation of neural stem cells in PD rat models.

[Key words] parkinsons disease ; substantia; pitx3

帕金森病(Parkinsons disease,PD)是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病,以震顫、肌強(qiáng)直及運(yùn)動(dòng)遲緩為主要臨床表現(xiàn),發(fā)病機(jī)制與腦內(nèi)的黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)多巴胺含量減少有關(guān)。研究PD模型大鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的死亡與再生具有重要的理論價(jià)值和臨床意義。pitx3基因?yàn)榇贵w同源盒基因家族的成員之一,其表達(dá)產(chǎn)物pitx3[1-2]是決定中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元表型、終末分化和生存維持的關(guān)鍵性特異性轉(zhuǎn)錄因子。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)6-OHDA紋狀體內(nèi)注射制作PD大鼠模型,觀察其腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)pitx3基因的表達(dá)情況。

1材料與方法

1.1PD模型的制作

雄性健康SD大鼠,體重200-250g,反復(fù)檢測(cè)確認(rèn)其無(wú)旋轉(zhuǎn)行為。0.4%的戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉,固定于立體定位儀上,常規(guī)消毒,開(kāi)顱。立體定位坐標(biāo)為兩點(diǎn):(參照Paxinos, Waston 大鼠圖譜),第一點(diǎn)AP1 0.2,ML1 3,DV1 5.5用微量注射器緩慢注入6-OHDA(濃度3μg/μl)3μl,留針10分鐘。提針至DV 4.5,進(jìn)藥3μl,第二點(diǎn)AP20.7,ML2 3DV25.5,進(jìn)藥過(guò)程同前。對(duì)照組定位點(diǎn)同前,注入等量的生理鹽水代替6-OHDA。于術(shù)后第7天,腹腔內(nèi)注射阿撲嗎啡(APO)(5mg/kg),記錄40分鐘旋轉(zhuǎn)次數(shù),第一周偶有旋轉(zhuǎn),1-2轉(zhuǎn)/min,第二周出現(xiàn)明顯旋轉(zhuǎn)4-5轉(zhuǎn)/min,第三周穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)7轉(zhuǎn)/min或以上者視為成功模型。

1.2分組

取成功模型30只。分為模型成功后7d組(10只),15d組(10只),30d組(10只)。另選取正常組3只,對(duì)照組(注入生理鹽水)6只。

1.3組織固定

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物深麻后心臟灌注肝素化的生理鹽水150ml,繼4%多聚甲醛灌注400ml。取全腦于4%多聚甲醛溶液后固定24h,入30%蔗糖溶液至沉底。

1.4組織切片

取中腦行冰凍冠狀切片,切片厚度30μm。

1.5免疫熒光檢測(cè)

冷凍切片置于PBS中洗5 min,然后用含0.3%曲拉通X-100的磷酸鹽緩沖溶液 (phosphate buffer saline Triton X-100,PBT)室溫下洗片30 min;再用10%山羊血清(用0.3%PBT配制),室溫下封閉2 h。隨后分別加一抗TH(1:500),pitx3(1:500)抗體, 4℃孵育過(guò)夜。0.3%PBT洗片后加山羊抗小鼠-FITC二抗(1:200),室溫孵育半小時(shí)后4℃過(guò)夜,遮光。0.3%PBS洗片,甘油封片后照相。對(duì)照實(shí)驗(yàn)用0.01 mol/L PBS代替一抗。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

免疫熒光顯微鏡觀察標(biāo)記細(xì)胞的表達(dá):每只大鼠取相同序列切片6張,隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)非重疊視野(400倍鏡下),采用圖像分析(OLYMPUS,DP Controller)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。半定量數(shù)據(jù)和細(xì)胞計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)。

2結(jié)果

黑質(zhì)區(qū)pitx3陽(yáng)性細(xì)胞的變化:正常大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)觀察到較多的pitx3/TH雙標(biāo)細(xì)胞,pitx3/TH(免疫熒光檢測(cè)顯示胞質(zhì)呈綠色熒光標(biāo)記的TH陽(yáng)性和胞核呈紅色熒光標(biāo)記的pitx3陽(yáng)性雙標(biāo)細(xì)胞,細(xì)胞多數(shù)呈圓形或梭形,胞體較大,有長(zhǎng)短不一的突起(圖)。PD模型成功后7天,黑質(zhì)區(qū)少見(jiàn)pitx3/TH雙標(biāo)細(xì)胞, 15天后稍有增加,30天后仍未見(jiàn)明顯增加。見(jiàn)表1。

3討論

中腦多巴胺能神經(jīng)元在控制自主運(yùn)動(dòng)和精神活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用,研究其發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控是近年來(lái)發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)的熱點(diǎn)之一。帕金森病導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡,再生的神經(jīng)細(xì)胞能否分化為多巴胺能神經(jīng)元及其調(diào)控的機(jī)制一直是研究者關(guān)心的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)選用的是6-OHDA紋狀體內(nèi)注射制作PD大鼠模型,由于注入紋狀體的6-OHDA須通過(guò)軸突逆行轉(zhuǎn)運(yùn)才能到達(dá)中腦黑質(zhì)的神經(jīng)元胞體,使得黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的損傷呈現(xiàn)出一種漸進(jìn)過(guò)程,更有利于模擬PD的發(fā)病過(guò)程[3]。本實(shí)驗(yàn)選取的7天,15天和30天的時(shí)間點(diǎn)能反映出多巴胺能神經(jīng)元在腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)的表化情況。

pitx3基因由Semina和Smidt于1996年和1997年先后發(fā)現(xiàn),屬于垂體同源盒基因家族成員?，F(xiàn)已確認(rèn),pitx3在胚胎發(fā)育的不同階段表達(dá)在三種不同的組織內(nèi),在 E11-E18 d,轉(zhuǎn)錄因子pitx3 表達(dá)在中腦DA能神經(jīng)元[4] 、晶狀體和骨骼肌。多數(shù)研究表明pitx3在腦內(nèi)僅在TH陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá),與TH幾乎同時(shí)開(kāi)始表達(dá),其表達(dá)和作用在腦內(nèi)的定位局限而且特異,是決定中腦SN區(qū)DA能神經(jīng)元表型、終末分化和生存維持的關(guān)鍵性特異性轉(zhuǎn)錄因子。

本實(shí)驗(yàn)觀察到正常成年大鼠黑質(zhì)中有較多的pitx3+/TH+細(xì)胞,排列緊密。成功制作PD模型后,傷側(cè)黑質(zhì)區(qū)的pitx3+/TH+細(xì)胞明顯減少,在有的腦片上甚至觀察不到,這主要是由于PD模型成功后第1周內(nèi),造成多巴胺能神經(jīng)元的大量死亡所致。并且損傷對(duì)側(cè)的黑質(zhì)區(qū)pitx3+/TH+細(xì)胞也有少量減少。在PD模型成功后的第14天,可以觀察到pitx3+/TH+細(xì)胞在黑質(zhì)區(qū)少量增多,但相比正常大鼠仍然較少。30天后觀察,損傷的黑質(zhì)區(qū)的pitx3+/TH+ 細(xì)胞未見(jiàn)明顯增加。有文章指出,PD大鼠模型成功后,海馬區(qū)有大量的神經(jīng)干細(xì)胞增殖[5],并可能遷移到黑質(zhì)區(qū),同時(shí)也有文章指出黑質(zhì)區(qū)本身也可有少量的神經(jīng)干細(xì)胞增殖,這些增殖的細(xì)胞在黑質(zhì)區(qū)有可能轉(zhuǎn)化為多巴胺能神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到,在PD模型成功后的2周左右,有少量的pitx3+/TH+細(xì)胞出現(xiàn)。但是其具體的來(lái)源以及分化的機(jī)制并不清楚。

pitx3基因在DA能神經(jīng)元發(fā)育中地位顯要[6,7],從實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果看,PD模型大鼠毀損側(cè)中腦黑質(zhì)pitx3基因的表達(dá)明顯地下調(diào),而且15天,30天后并沒(méi)有明顯的增加。盡管以前的研究結(jié)果證實(shí)了PD大鼠模型自體神經(jīng)干細(xì)胞存在增殖的現(xiàn)象,但是從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出自體增殖的神經(jīng)干細(xì)胞僅僅有少數(shù)有可能轉(zhuǎn)化為有功能的多巴胺能神經(jīng)元。因此,怎樣能夠定向的引導(dǎo)新生神經(jīng)干細(xì)胞的分化為多巴胺能神經(jīng)元將是今后研究迫切需要解決的問(wèn)題。

參考文獻(xiàn):

[1] Smidt M P, van Schaick H S, Lanctot C, et al. A homeodomain gene Pitx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons [J]. Proc Natl Acad Sci, 1997,94(24):13305-13310.

[2] van Den Munckhof P, Luk K C, Ste Marie L, et al. Pitx3 is required for motor activity and for survival of a subset of midbrain dopaminergic neurons [J]. Development, 2003,130(11):2535-2542.

[3] 趙煥英,蘇月,等.6-羥多巴胺紋狀體內(nèi)注射制作大鼠帕金森模型的研究.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2003 12(1):16.

[4] Maxwell S L, Ho H Y, Kuehner E,et al. Pitx3 regulates tyrosine hydroxylase expression in the substantia nigra and identifies a subgroup of mesencephalic dopaminergic progenitor neurons during mouse development[J]. Dev Biol,2005,282(2):467-479.

[5] 王磊,曾水林,李濤,等.帕金森模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況的試驗(yàn)研究.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào),2005,26(3):21.

[6] Nunes I, Tovamasian L T, Silva R M , et al. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons[J]. Proc Natl Acad Sci, 2003,100 ( 7 ) : 4245-4250.

[7] Smidt M P, Smits S M, Peter J H, et al.Molecular mechanisms underlying midbrain dopamine neuron development and function [J]. Eur J Pharmacol, 2003,480(1-3):75-88.

(收稿日期2009-06-05)