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(1.廣東藥學(xué)院 中山校區(qū)實驗中心，廣東 中山 528458；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 實驗動物中心，廣東 廣州 510405)

胃癌是一種常見的對人類危害較大的疾病，我國在20世紀(jì)90年代進行的全國惡性腫瘤死亡率調(diào)查表明，胃癌死亡率高居惡性腫瘤死亡率的首位[1]，目前使用手術(shù)、化療、放療等治療方法存在許多局限，而且不能有效防治胃癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從活血化瘀中藥川芎中分離得到的一種生物堿，主要應(yīng)用于缺血性心、腦血管疾病，毒副作用少。有研究發(fā)現(xiàn)[2]，川芎嗪對MKN45人胃癌低分化腺癌細(xì)胞有直接的殺傷作用；張薇等[3]的研究則顯示川芎嗪能抑制胃癌前病變大鼠新生血管生成，可能對胃癌具有一定的預(yù)防和治療作用。本文擬通過MTT比色法觀察川芎嗪對胃癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，初步探討川芎嗪在胃癌治療中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 材料 RMPI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco)，SFM培養(yǎng)基(美國Gibco)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，谷氨酰胺(美國Amresco，博理分裝)，重組人β內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(rhβ-ECGF,美國R&D)，F(xiàn)8兔抗人多克隆抗體、FITC-羊抗兔IgG(武漢博士德)，鹽酸川芎嗪注射液(常州制藥廠有限公司，規(guī)格：40 mg/2 mL，批號：0403231)，MTT(美國Amersco，博理分裝)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901胃腺癌細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，用RMPI 1640完全培養(yǎng)基(加入10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺)培養(yǎng)。

1.2.2 HUVEC培養(yǎng) 采用胰蛋白酶消化法分離獲取[4-5]。用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1 ng/mL rhβ-ECGF的SFM培養(yǎng)基)培養(yǎng)，傳代后用第八因子相關(guān)抗原免疫熒光染色法進行鑒定。HUVEC第3～6代用于實驗。

1.2.3 川芎嗪對細(xì)胞增殖影響的檢測

1.2.3.1 對胃腺癌細(xì)胞增殖的影響 SGC-7901胃腺癌細(xì)胞以1×104個/mL的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL，用RMPI 1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中培養(yǎng)基。每塊培養(yǎng)板分4組，每組6個復(fù)孔。正常對照組加入100 μL/孔RMPI 1640完全培養(yǎng)基；川芎嗪組則將含川芎嗪25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的RMPI-1640培養(yǎng)基依次加入相應(yīng)的孔中，每孔100 μL。藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養(yǎng)板，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況(檢測490 nm處光吸收值)。

1.2.3.2 對無因子培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 HUVEC以2×104個/mL的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL，用SFM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和2 mM谷氨酰胺)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中培養(yǎng)基。每塊培養(yǎng)板分4組，每組6個復(fù)孔。正常對照組則加入100 μL/孔SFM完全培養(yǎng)基；川芎嗪組則將含25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的SFM完全培養(yǎng)基依次加入相應(yīng)孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養(yǎng)板，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況(檢測490 nm處光吸收值)。

1.2.3.3 對胃腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC增殖的影響 胃腺癌細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶接種以1.5×106個/mL，加入SFM完全培養(yǎng)基至5 mL。培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)上清吸至同一離心管內(nèi)，1 500 r/min離心10 min。離心后的上清收集于新的離心管內(nèi)，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

HUVEC以2×104個/mL的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL，共接種3個培養(yǎng)板，用SFM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中培養(yǎng)基。每塊培養(yǎng)板分7組，每組6個復(fù)孔。正常對照組加入100 μL/孔的SFM完全培養(yǎng)基；條件對照組加入100 μL/孔的條件培養(yǎng)基(將上述收集的胃腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清與SFM完全培養(yǎng)基按1∶1的比例混勻)；川芎嗪組將含川芎嗪終濃度為25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的條件培養(yǎng)基依次加入相應(yīng)各孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養(yǎng)板，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 上述實驗各進行2次，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理,相同時間點均數(shù)間兩兩比較使用單因素方差分析，方差齊則用LSD-t檢驗，方差不齊用Dunnett’s-C檢驗。

2 結(jié)果

2.1 對胃腺癌細(xì)胞的影響 經(jīng)不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表1。各川芎嗪組A值與相同時間的正常對照組相比較(P>0.05)。

表1 不同濃度川芎嗪對胃腺癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 對HUVEC增殖的影響 經(jīng)不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表2。各川芎嗪組A值與相同時間的正常對照組相比較(P>0.05)。

表2 不同濃度川芎嗪對正常培養(yǎng)條件HUVEC增殖的影響

2.3 對條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVEC增殖的影響 經(jīng)不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表3；各川芎嗪濃度組抑制率見表4。各組光吸收值均隨培養(yǎng)時間的延長而升高；條件對照組和各川芎嗪組A值高于相同時間的正常對照組，差異有顯著性(P<0.05)；川芎嗪濃度為125 μg/mL(川芎嗪4組)作用48、72 h、濃度為625 μg/mL(川芎嗪5組)作用24、48、72 h對SGC-7901胃癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC增殖有明顯影響(P<0.05)，川芎嗪濃度為125～625 μg/mL時，增殖抑制率隨著作用時間的延長而升高(見表4)。

表3 不同濃度川芎嗪對條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC的增殖的影響

表4 不同濃度川芎嗪對條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVEC增殖的抑制

3 討論

川芎嗪在臨床主要應(yīng)用于缺血性心、腦血管疾病，同時能通過直接抑制腫瘤、化療增效與減毒作用、調(diào)節(jié)免疫機制等作用達到抗腫瘤效應(yīng)；能通過下調(diào)腫瘤多藥耐藥基因蛋白(P-gp)而克服腫瘤細(xì)胞耐藥性;通過影響腫瘤細(xì)胞黏附與侵襲、抗凝血與抗血小板集聚作用而發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用[5]。研究者還發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可有效抑制大鼠胃癌前病變組織和小鼠Lewis肺癌組織中微血管增生[3,6]，從而減少腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。 本研究顯示，川芎嗪對SGC-7901細(xì)胞和HUVEC無直接殺傷作用，但對胃癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVEC的增殖具有抑制作用。反映川芎嗪可通過抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮預(yù)防和治療作用。腫瘤細(xì)胞能分泌各種促血管生成因子，這些因子與其相應(yīng)的受體相結(jié)合，是促使腫瘤新生血管增殖、遷移和形成管腔的重要原因[7-8]，故川芎嗪對胃癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用，可能與影響胃腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基中促血管生長因子與其受體結(jié)合的中間環(huán)節(jié)有關(guān)。研究表明[9-10]，川芎嗪抑制腫瘤新生血管生成的作用可能與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的表達有關(guān)，但川芎嗪對這兩種因子影響的具體作用機制目前不甚明了，是否對其它因子或受體具有抑制作用也尚未清楚，因此要明確川芎嗪抑制腫瘤新生血管生成的具體機制和作用環(huán)節(jié)仍需進一步研究。

[1]孫秀娣,牧 人,周有尚,等.中國胃癌死亡率20年變化情況分析及其發(fā)展趨勢預(yù)測[J].中華腫瘤雜志,2004,26(1):4-9.

[2]張振玉,王崇文,祝金泉,等.川芎嗪及聯(lián)用化療藥物對胃癌細(xì)胞殺傷作用的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,1999,9(1):68-69.

[3]張 薇,王茵萍,鄒移海,等.川芎嗪對胃癌前病變大鼠新生血管生成相關(guān)因素的影響[J].長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,21(5):24-26.

[4]Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by morphologic and immunologic criteria[J].J Clin Invest,1973,52(11):2 745-2 756.

[5]Marin V,Kaplanski G,Gres S,et al.Endothelial cell culture:protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells[J].J Immunol Methods,2001,254(1-2):183-190.

[6]趙永辰,陳信義.川芎嗪臨床應(yīng)用研究[J].中國醫(yī)藥學(xué)報,2002,17(1):54-57.

[7]王 昕,陳信義.川芎嗪對腫瘤細(xì)胞影響研究概況與展望[J].中國中藥雜志,2003,28(4):295-298.

[8]徐曉玉,嚴(yán)鵬科,陳 剛,等.川芎嗪對小鼠肺癌血管生長和VEGF表達的抑制[J].中國藥理學(xué)通報,2004,20(2):151-154.

[9]Kerbel R,Folkman J.Clinical translation of angiogenesis inhibitors[J].Nat Rev Cancer,2002,2(10):727-739.

[10]Sato Y.Molecular diagnosis of tumor angiogenesis and anti-angiogenic cancer therapy[J].Int J Clin Oncol,2003,8(4):200-206.