張德雙 張鳳蘭 徐家炳

（北京蔬菜研究中心，100097）

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553多類(lèi)型再生植株的獲得

張德雙 張鳳蘭 徐家炳

（北京蔬菜研究中心，100097）

應(yīng)用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)對(duì)兼具有A，B，C染色體組的蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553（AABBCC，n= 27）材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。結(jié)果表明，供試材料具有胚胎發(fā)生能力，并獲得DH再生植株。220份馴化后的再生植株定植于日光溫室中自交留種，其中12株獲得自交種子。分別將DH植株與3份大白菜品種正、反交授粉雜交，得到4份雜交種F1代。經(jīng)田間植物學(xué)鑒定，獲得的雜交種為真正的雜種。目前，4份雜交種的染色體組成、倍性、育性等正在研究中。所獲得的DH植株為今后構(gòu)建遺傳圖譜，標(biāo)記和定位重要的基因等后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553 游離小孢子培養(yǎng) 再生株 大白菜 雜種一代

在蕓薹屬作物中，3個(gè)二倍體基本種 （或原始種）分別是:蕓薹（Brassica campestris，2n=20，AA）、甘藍(lán)（Brassica oleracea，2n=18，CC）、黑芥（Brassica nigra，2n=16，BB）。由3個(gè)基本種衍生的3個(gè)異源四倍體（雙二倍體）復(fù)合種(或次生種)分別是：甘藍(lán)型 油 菜 （Brassica napus，2n=38，AACC）、 芥 菜（Brassica junceae，2n=36，AABB）和埃塞俄比亞芥（Brassica carinata，2n=34，BBCC）。蕓薹屬作物3個(gè)二倍體基本種和3個(gè)異源四倍體復(fù)合種之間的遺傳關(guān)系已經(jīng)研究得非常清楚。早在1935年，日本科學(xué)家就提出禹氏三角（U’triangle）表示它們之間的關(guān)系[1]。正確理解蕓薹屬不同種各單染色體組之間的關(guān)系，不僅有助于解釋蕓薹屬各個(gè)種之間的進(jìn)化關(guān)系，而且將加快蕓薹屬種間的基因轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造蕓薹屬的新資源。研究表明，A，C基因組來(lái)源于相同或相似的基因型，B基因組可能來(lái)自另一個(gè)地理生境，因此，A，C基因組間的親緣關(guān)系要比它們與B基因組的關(guān)系密切[2～5]。Attia等[2]研究不同雙單倍體雜種中染色體配對(duì)和交叉頻率，發(fā)現(xiàn)A和C基因組染色體之間的配對(duì)情況遠(yuǎn)好于A，B和B，C，這說(shuō)明A和C基因組之間可能具有較近的親緣關(guān)系。但是，白菜與甘藍(lán)無(wú)法通過(guò)常規(guī)育種手段直接雜交獲得雜交后代，通常采用體細(xì)胞雜交或原生質(zhì)體融合和胚拯救等技術(shù)獲得二者種間雜種，而白菜（Brassica campestrisL.ssp.pekinensis，2n=20，AA）與甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，2n=38，AACC）極易雜交，這些都表明A，B，C染色體組間既存在相似性，又存在復(fù)雜性。

北京蔬菜研究中心引進(jìn)了一份蕓薹屬異源六倍體復(fù)合種CGMCC No.2553材料，該材料兼具有A，B和C染色體基因組。研究表明，應(yīng)用常規(guī)的方法，蕓薹屬異源六倍體復(fù)合種CGMCC No.2553可以與大白菜雜交，但結(jié)實(shí)率極低。由于蕓薹屬異源六倍體基因組組成較為復(fù)雜，所以先采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)快速純合重要性狀，創(chuàng)造更多能與大白菜雜交的蕓薹屬新種質(zhì)，將獲得的多類(lèi)型DH單株與大白菜品種雜交，獲得二者的雜交后代。

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蕓薹屬作物中，國(guó)內(nèi)已成功將甘藍(lán)型油菜、大白菜等作物的小孢子培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于育種實(shí)踐中，并選育出品種。利用小孢子培養(yǎng)獲得的DH再生植株不僅可以縮短常規(guī)育種周期，而且應(yīng)用DH永久群體構(gòu)建的遺傳圖譜可以用來(lái)標(biāo)記重要性狀，定位、克隆重要基因等。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553（AABBCC，n=27）兼具有A，B和C染色體基因組，雖為同一株采收的種子，但蕓薹屬異源六倍體CGMCCNo.2553個(gè)體間差異較大。表現(xiàn)為：有的植株葉片有缺刻，有的植株葉片為板葉；花色有黃花和白花等；莖部有紫色，淺紫色，淺綠色帶蠟粉等。蕓薹屬異源六倍體苗期照片如圖1，抽薹、現(xiàn)蕾期照片如圖2。

1.2 試驗(yàn)方法

①游離小孢子培養(yǎng) 10月中旬，將蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553萌動(dòng)種子放于4℃冰箱中人工春化15～20 d，11月初播種于日光溫室，待長(zhǎng)到一定苗齡后定植到日光溫室。在第2年盛花期取材，參考已發(fā)表的綠菜花游離小孢子培養(yǎng)方法[6]，對(duì)供試材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

②DH再生植株的獲得、留種暗培養(yǎng)20 d后，小孢子胚發(fā)育到子葉期，將子葉胚轉(zhuǎn)接到裝有B5固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后再轉(zhuǎn)移根、莖、葉分化良好的幼苗到三角瓶中，多次繼代后獲得發(fā)育健壯的再生苗，馴化后，定植于日光溫室中，人工蕾期自交留種。

③DH再生植株與大白菜雜交種的獲得、鑒定 在DH再生植株自交留種的同時(shí)，取DH再生植株的花粉分別涂抹到3份大白菜品種柱頭上或取大白菜的花粉涂抹到DH再生植株上，獲得二者間的雜交種子。播種收獲的種子，通過(guò)田間性狀觀察的方法，鑒定雜種的真實(shí)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DH再生植株的獲得

圖1 蕓薹屬異源六倍體的苗期

圖2 蕓薹屬異源六倍體抽薹、現(xiàn)蕾期

圖3 蕓薹屬異源六倍體的子葉胚和胚誘導(dǎo)成苗

圖4 蕓薹屬異源六倍體的再生苗

圖5 蕓薹屬異源六倍體再生植株的不同類(lèi)型

圖6 蕓薹屬異源六倍體的再生植株群體（抽薹、開(kāi)花）

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553材料具有胚胎發(fā)生能力，可以獲得胚狀體和再生植株。圖3為獲得的子葉胚、子葉胚轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)成苗。由圖3可見(jiàn)，一次培養(yǎng)獲得的胚狀體數(shù)量不多，說(shuō)明基因型明顯影響胚胎發(fā)生能力。轉(zhuǎn)移健壯的幼苗到三角瓶中繼續(xù)生長(zhǎng)、分化，形成再生苗（圖4）。圖4為定植前的再生植株。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，供試材料的子葉胚極易分化出多個(gè)再生苗或再生植株，表現(xiàn)為“一胚多苗”的現(xiàn)象，這不僅有利于獲得同一基因型的多個(gè)再生植株，而且提高了再生株定植成活率。圖5為蕓薹屬異源六倍體再生植株的不同表現(xiàn)。由圖5可見(jiàn)，再生植株主要表現(xiàn)為葉片缺刻的深、淺，紫色的有無(wú)等區(qū)別。圖6為蕓薹屬異源六倍體再生植株群體。由圖6可見(jiàn)，DH植株花期長(zhǎng)勢(shì)旺，植株高，分枝多。圖7為蕓薹屬異源六倍體再生植株的花。由圖7可見(jiàn)，花瓣顏色有黃色、白色，雄蕊有的可育，有的不育，雄蕊的長(zhǎng)短不同等。圖8為蕓薹屬異源六倍體再生植株的花穗、結(jié)實(shí)。由圖8可見(jiàn)，DH再生植株的花較大，結(jié)實(shí)性好，但每莢中種子數(shù)量較少。圖9為蕓薹屬異源六倍體的再生植株的分枝和根部狀況。由圖9可見(jiàn)，由根部萌發(fā)的主枝較多，最多可以達(dá)到3～4個(gè)。DH再生植株經(jīng)過(guò)一定的低溫處理，可以獲得一些葉片皺縮突變體（圖10）。圖11為再生植株與大白菜的雜交種。由圖11可見(jiàn)，雜交種表現(xiàn)為中間類(lèi)型，性狀更偏向于大白菜。

圖7 蕓薹屬異源六倍體不同再生植株的花

圖8 蕓薹屬異源六倍體的再生植株花穗、結(jié)實(shí)

綜上所述，獲得的DH再生植株性狀差異較大，表現(xiàn)為類(lèi)型多樣、性狀各異等。性狀主要表現(xiàn)為：花色有黃色、白色和淺黃色；花粉有的多，有的少，有的全無(wú)；同一朵花的雄蕊有的可育，有的不育，6個(gè)雄蕊的長(zhǎng)短也不同等?？梢?jiàn)，對(duì)蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，可以獲得多種類(lèi)型的中間材料，而且也可以獲得與大白菜雜交的中間類(lèi)型材料。

2.2 DH再生植株的自交結(jié)實(shí)

2007-2008年，在日光溫室中共定植220株DH再生植株。在蕾期，采用人工剝蕾的方法自交留種。目前僅獲得12株DH再生植株的自交種子，其余208株再生株因?yàn)榍捌跓o(wú)花粉、花粉少，染色體基因型不配對(duì)等內(nèi)在原因，自交后沒(méi)有得到種子。但是，在208株DH再生植株中，部分沒(méi)有套袋的枝條可以獲得若干種子，這些種子是自交種子還是雜交種子還有待進(jìn)一步鑒定。另外，有的DH再生植株初花期花粉量較多，后期逐漸減少，而且多次重復(fù)授粉很難得到自交種子，其原因有待于進(jìn)一步研究。

圖9 蕓薹屬異源六倍體再生植株的分枝和根部狀況

圖10 再生植株葉片皺縮突變體

更有意義的是，將再生植株置于4～5℃低溫條件下處理15～20 d或自然慢慢通過(guò)低溫處理30～40 d后，定植到日光溫室中生長(zhǎng)，在生育后期可以獲得一些葉片皺縮突變體 （圖10）。試驗(yàn)證明，2007-2008年，采用上述方法重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，每次都能獲得一定數(shù)量的葉片皺縮突變體。

2.3 大白菜與DH再生株雜交F1代的獲得及鑒定

采用3份大白菜 （08-784，08-786和08-916）分別與DH再生株正反交雜交，部分雜交可以正常結(jié)實(shí)，目前，已經(jīng)得到4份雜交F1代種子，并獲得了幼苗。通過(guò)田間植物學(xué)性狀鑒定，認(rèn)為是真正雜種。同時(shí)，正在采用SSR等分子標(biāo)記技術(shù)鑒定雜交種的真?zhèn)涡浴?/p>

3 小結(jié)與討論

3.1 游離小孢子培養(yǎng)

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553的游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程與綠菜花的培養(yǎng)技術(shù)相似，熱激處理溫度為32.5℃1 d，蔗糖濃度以10%為宜。因蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553花蕾較大，取材時(shí)健康花蕾長(zhǎng)度在2.0～3.5 mm為宜。蕓薹屬異源六倍體的胚胎發(fā)生率較低，因?yàn)闆](méi)有詳細(xì)地研究影響供試材料胚胎發(fā)生的各種因素，從而優(yōu)化培養(yǎng)條件，因此，沒(méi)有獲得較高的胚胎發(fā)生率。供試材料單個(gè)胚的成苗率較高，一般一個(gè)胚可以分化成3株或更多的再生苗，這種現(xiàn)象在大白菜品種的游離小孢子培養(yǎng)中很少發(fā)現(xiàn)?！耙慌叨嗝纭钡膬?yōu)點(diǎn)首先是能夠提高DH再生株的成活率，其次有利于獲得基因型相同而某些性狀不同的突變型和野生型材料，如本研究中獲得的葉片皺縮突變體。由于它們只在葉片皺縮單一性狀上表現(xiàn)差異，而其他的遺傳性狀完全一致，因此它們是很好的野生型和突變型材料，為研究葉片皺縮的遺傳規(guī)律，定位、克隆和分離葉片皺縮基因，并探討葉片皺縮性狀在育種中作為標(biāo)記性狀的應(yīng)用等提供了可能。

3.2 再生株自交結(jié)實(shí)

在游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553的染色體會(huì)發(fā)生隨機(jī)重組、交換等，出現(xiàn)A，B，C染色體間的多種組合，隨后有的自然加倍，成為二倍體、異源四倍體或其他多種倍性，因此，DH再生株會(huì)出現(xiàn)許多類(lèi)型，表現(xiàn)在葉片缺刻、莖部顏色、花瓣顏色、花藥多少、育性、倍性等性狀的不同。在盛花期，有的DH植株由于無(wú)花粉、花粉干或花粉不穩(wěn)定、染色體不配對(duì)等，導(dǎo)致自交不結(jié)實(shí)，在本研究中，220株再生植株僅獲得12株再生株的自交種子。

3.3 大白菜與DH再生植株雜交種的獲得

所獲得的DH單株可以與3份大白菜正反交雜交的F1部分雜交結(jié)實(shí)正常。目前，已經(jīng)驗(yàn)證了獲得的F1代為真正的雜交種?？梢?jiàn)，以蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553為材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，不僅拓寬了蕓薹屬的種質(zhì)資源，而且獲得的部分DH再生株可以與大白菜品種雜交，為今后獲得大白菜DH永久作圖群體，構(gòu)建遺傳圖譜，開(kāi)展相關(guān)基因的研究奠定了基礎(chǔ)，也為研究蕓薹屬A，B和C染色體的共線性提供了依據(jù)。

[1]U N.Genome analysis inBrassicawith special reference to the experimental formation ofB.napusand its peculiar mode of fertilization[J].Jap J Bot,1935,7:389-452.

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Regeneration of Plant with Multiple Types from Allohexaploid CGMCC No.2553 in Brassica

ZHANG Deshuang,ZHANG Fenglan,XU Jiabing
(Beijing Vegetable Research Center,Beijing 100097)

Crossing with Chinese cabbage (Brassica campestrisL.ssp.Pekinensis),Brassicaallohexaploid CGMCC No. 2553 (AABBCC,n=27),which owns A,B and C chromosomes simultaneously,was used for isolated microspore culture. The results showed that it could form embryoid and could get regenerated plants.220 regenerated plants were grown at the greenhouse without heating apparatus.12 DH plants got seeds by self-pollination.Through crossing DH lines with 3 Chinese cabbage pure lines,4 F1hybrids were obtained.These hybrids were genuine hybrids by field checkup.They will be used for linkage map construction,locating and cloning the important genes in the future.

Brassicaallohexaploid CGMCC No.2553;Isolated microspore culture;Regeneration of plants;Chinese cabbage;Hybrid F1

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.005

北京市農(nóng)林科學(xué)院青年基金資助

張德雙（1969－），男，博士，副研究員，主要從事大白菜育種等研究工作，電話:010-51503038

2008-12-15