楊國志 張明方 顧掌根 緱艷霞

（1.浙江嘉興市農科院，314016；2.浙江大學園藝系；3.呼和浩特職業(yè)技術學院）

NaN3處理條件下西瓜直接再生試驗體系研究

楊國志1張明方2顧掌根1緱艷霞3

（1.浙江嘉興市農科院，314016；2.浙江大學園藝系；3.呼和浩特職業(yè)技術學院）

以西瓜純種自交系伊選為材料，研究了化學誘變劑NaN3對西瓜直接再生試驗體系的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著疊氮化鈉濃度的升高，顯著的延遲了種子萌發(fā)、胚根發(fā)生、子葉開展、不定芽分化、伸長以及生根的時間，降低了芽分化頻率和每個外植體分化的不定芽數(shù)。1.5 mmol/L的NaN3振蕩處理1.5 h為最佳的誘變處理，使外植體再生頻率降低到40.0%，不定芽數(shù)/外植體降低到4.3，符合抗冷突變體半致死劑量的要求。

化學誘變 NaN3不定芽分化 半致死劑量

利用化學誘變劑，能誘導無性系的高頻率變異，通過一定的選擇壓力，可以篩選到一些有益的突變性狀和性狀優(yōu)良的突變體。本試驗以西瓜自交系純種伊選為材料，采用化學誘變和植物組織培養(yǎng)相結合的方法，誘導和篩選西瓜抗冷突變體，建立在化學誘變劑處理條件下的西瓜直接再生試驗體系，確定西瓜子葉生長、不定芽分化的最佳誘變濃度以及最適培養(yǎng)條件，確定抗冷突變體的半致死劑量；并對種子的發(fā)芽率、分化的不定芽數(shù)等進行統(tǒng)計和形態(tài)觀察。為以后化學誘變劑存在條件下的西瓜體細胞無性系變異、基因轉化和突變體后代遺傳鑒定分析等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所選用的材料為優(yōu)質自交系純種伊選（‘YiXuan’YX-04），以子葉剛剛展開的無菌苗的下胚軸與子葉之間再生能力強的部位作外植體，用來分化不定芽。

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件為發(fā)芽培養(yǎng)基：MS＋20 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂；芽分化培養(yǎng)基：MS+5 mg/L BA+ 0.1 mg/L IAA，芽伸長培養(yǎng)基：MS＋0.1 mg/L KT；生根培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L NAA。上述培養(yǎng)基均用1 mol/L的NaOH或HCL將pH值調至5.8，121℃恒溫滅菌20 min[1]。

1.2 試驗處理

NaN3濃度用0.1 mol/L，pH值3.0的磷酸緩沖液配制NaN3溶液，過濾滅菌，設4個誘變濃度處理分別為 0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L。以磷酸緩沖液（CK2：0.1 mol/L磷酸緩沖液處理種子1.5 h）和不加磷酸緩沖液與疊氮化鈉（CK1：沒有做任何處理）處理為對照。

1.3 試驗方法

①將成熟、飽滿一致的伊選種子在30℃的蒸餾水中浸泡5～6 h，小心去殼后浸入10%次氯酸鈉溶液中，置搖床上振蕩消毒10 min。用無菌水沖洗消毒后的種子3～4次，然后將其接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上。先在黑暗條件下28℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待90%以上種子胚根露出0.5～3 mm以后，將其轉移到25℃，35～40 μmol·（m2·s）-1光照培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至子葉展開，用于分化不定芽。

②將成熟、飽滿一致的伊選種子在30℃的蒸餾水中浸泡5～6 h，小心去殼后用0.1 mol/L，pH值3的磷酸緩沖液振蕩處理（180 r/min，25℃）1.5 h。再用自來水沖洗3～4 h，浸入10%次氯酸鈉溶液中，置搖床上振蕩消毒10 min。用無菌水多次沖洗消毒，然后將其接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上。以下步驟同①。

③選取成熟、飽滿一致的伊選種子浸泡5～6 h，小心去殼后用0.1 mol/L，pH值3的磷酸緩沖液配制的規(guī)定濃度的NaN3振蕩處理（180 r／min，25℃ ）1.5 h。NaN3濃 度 分別為0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L。種子經誘變劑處理后，用自來水沖洗3～4 h，再浸入10%次氯酸鈉溶液中，置搖床上振蕩消毒10 min。然后將用無菌水多次沖洗消毒后的種子接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上。以下步驟同①。

④芽分化、伸長和生根培養(yǎng)。每個處理接種30粒種子，設3次重復。待種子發(fā)芽后，統(tǒng)計種子發(fā)芽率、胚根伸長量和子葉開展與時間的關系。以剛剛開展的子葉為外植體，將展開子葉的近軸端（帶1 mm左右的下胚軸）外植體接種到誘導不定芽分化培養(yǎng)基上 （MS+30 g蔗糖＋7 g瓊脂＋BA 5 mg/L+IAA 0.1 mg/L，本研究后面所用培養(yǎng)基均加30 g蔗糖和7 g瓊脂，pH值均調至5.8）。每個處理接種5個外植體，設3次重復。直至不定芽長至0.5～1.0 cm時。統(tǒng)計芽分化時間、植株再生頻率和平均芽數(shù)。

將分化后的不定芽（芽長0.5～1.0 cm）轉到芽伸長培養(yǎng)基上進行伸長培養(yǎng)（CK1和CK2直接接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，統(tǒng)計生根所需天數(shù)），待不定芽在伸長培養(yǎng)基上長至1.5～2.0 cm后，對不定芽進行形態(tài)觀察并統(tǒng)計伸長時間。

將不定芽自基部切下，轉到MS＋0.1 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)20 d左右，待根生長到2～3 cm時，對不定芽進行形態(tài)觀察并統(tǒng)計生根時間。生根幼苗在5℃低溫處理2 d，0℃低溫處理1 d后，轉到培養(yǎng)室繼續(xù)正常培養(yǎng)1周，然后開瓶煉苗2 d，洗掉根部的培養(yǎng)基后移栽到裝有蛭石的營養(yǎng)缽中。用塑料薄膜遮蓋以保濕，并保持適當通風透氣，期間澆灌1/2的MS營養(yǎng)液。4 d后揭去薄膜，在有散射光的室內培養(yǎng)5 d，然后移栽到溫室培養(yǎng)。

⑤半致死劑量及相關關系的確定。半致死劑量是誘變育種適宜誘變劑量的參考，以不同濃度疊氮化鈉處理產生的不定芽的再生頻率計算其半致死劑量，即以不同誘變劑量x為自變量，不同劑量下的不定芽的再生頻率y為因變量，利用直線回歸方程y=a+bx和下列公式來計算誘變育種適宜的半致死劑量。式中，b為回歸系數(shù)；a為常數(shù)；x為所求半致死劑量。

相關系數(shù)反應了不同的不定芽的再生頻率與誘變劑量的相關性質及其緊密程度。相關系數(shù)為：

2 結果與分析

2.1 NaN3處理對西瓜發(fā)芽率和成苗率的影響

從表1可以看出，磷酸緩沖液對照處理和未做任何處理的對照之間對西瓜的發(fā)芽率和成苗率的影響沒有區(qū)別。但隨著NaN3濃度的增加，伊選的發(fā)芽率和成苗率呈逐漸下降的趨勢，當NaN3濃度為1.0 mmol/L時，發(fā)芽率和成苗率分別為66.7%和60.0%；當NaN3濃度為1.5 mmol/L時，發(fā)芽率和成苗率還保持在55.0%左右，但當NaN3濃度變?yōu)?.0 mmol/L時，伊選的發(fā)芽率和成苗率則分別驟降到30.0%和33.3%。相對1.5 mmol/L時，發(fā)芽率和成苗率同比分別下降了47.1%和70%。伴隨著NaN3濃度的升高，幼苗畸形的比例也相應增加，主要表現(xiàn)為幼苗矮化，胚根變細，子葉葉面積變小，子葉上部發(fā)白或發(fā)黃，子葉變硬等。

表1 NaN3處理對西瓜子葉伸展和西瓜不定芽直接再生的影響

2.2 NaN3處理對西瓜胚根伸長的影響

低濃度的NaN3處理對胚根的伸長影響較小，0.5 mmol/L濃度處理的種子在第3 d胚根就伸長到2.0 mm左右。1.0 mmol/L濃度處理的種子胚根伸長趨勢和0.5 mmol/L濃度處理的種子相似。但高濃度的NaN3處理則顯著的抑制了胚根的伸長，當NaN3濃度達到1.5 mmol/L時，明顯的抑制了胚根的伸長生長，在第3 d胚根才伸長到0.5 mm，第6 d胚根才僅僅2.0 mm。當NaN3濃度為2.0 mmol/L時，胚根在前4 d基本沒有伸長，到第6 d時也只有1.5 mm長。而2個對照之間胚根的伸長幾乎沒有差別，都在第2 d的時候達到5 mm左右。

2.3 NaN3處理對西瓜子葉伸展的影響

將在黑暗條件下28℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)的種子轉到光照培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)，觀察子葉伸展的情況，統(tǒng)計從黑暗條件下培養(yǎng)到光下培養(yǎng)，子葉剛剛開展所需要的時間。

從表1可以看出，低濃度的NaN3處理對子葉伸展所需時間基本無影響，0.5 mmol/L濃度處理和1.0 mmol/L濃度處理在第4 d的時候子葉開展；而高濃度的NaN3處理則明顯延長了子葉伸展的時間，隨著NaN3濃度的增大，子葉伸展時間最多的延遲了5 d。磷酸緩沖液對照處理和未做任何處理的對照對子葉的伸展影響一致，子葉都在第3 d的時候展開。

2.4 NaN3處理對西瓜不定芽分化的影響

①NaN3處理對不定芽生長的影響 將展開子葉的近軸端（帶1 mm左右的下胚軸）外植體接種到誘導不定芽培養(yǎng)基上。直至不定芽長至0.5～1.0 cm。統(tǒng)計芽分化時間、植株再生頻率和平均不定芽數(shù)/外植體。磷酸緩沖液對照處理和未做任何處理的對照之間不定芽的分化情況基本一致，都在10 d左右出現(xiàn)，在15 d左右不定芽伸長到6～7 mm。低濃度的NaN3處理對不定芽分化影響較小，中等濃度和高濃度的NaN3處理對不定芽分化影響較大，不僅延遲了芽分化的時間，而且分化出的不定芽葉片比沒有經過處理的葉片細，出現(xiàn)皺縮，生長緩慢，外植體邊緣有輕度黃化現(xiàn)象。如2.0 mmol/L濃度處理在16 d時才有不定芽產生，在25 d時不定芽的伸長也僅僅有5 mm。

②NaN3處理對不定芽直接再生的影響 試驗結果表明，高濃度的NaN3溶液處理對西瓜直接再生不定芽的再生頻率、不定芽數(shù)都有顯著影響。從表1可以看出，1.0 mmol/L和1.5 mmol/L處理無論對再生頻率還是不定芽數(shù)的影響都比較適中，既能保證獲得一定數(shù)量的不定芽，又能達到一定的選擇效果，基本上符合半致死處理條件。求得的直線回歸方程為y=-0.253x+0.8，誘變的半致死劑量為1.18 mmol/L，相關系數(shù)為0.93。1.5 mmol/L處理和2.0 mmol/L處理，分別使再生頻率降低到40.0%和33.3%，每個外植體分化的平均不定芽數(shù)分別降低到4.3個和3.4個。與對照CK1和CK2的再生頻率100%和平均芽數(shù)7.8個相比，差異極顯著。1.0 mmol/L和1.5 mmol/L處理再生頻率間差異不顯著?？紤]到突變頻率的提高和突變體植株發(fā)生數(shù)量的關系，直接再生途徑NaN3處理誘導體細胞無性系變異試驗中，采用1.5 mmol/L濃度處理誘導子葉外植體不定芽的發(fā)生較好，既能得到較高的突變頻率，又能保證得到一定數(shù)量的突變體植株。

③NaN3對不定芽伸長的影響 CK1和CK2在芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，將再生芽自芽基部切下插入生根培養(yǎng)基直接生根培養(yǎng)。而NaN3處理過的種子分化的不定芽在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，則接種到伸長培養(yǎng)基上繼續(xù)伸長培養(yǎng)。0.5 mmol/L處理的不定芽生長較快，不定芽10 d左右就伸長到2.0～2.5 cm，1.0 mmol/L處理的不定芽生長趨勢和0.5 mmol/L處理的不定芽生長趨勢一致，在15 d左右達到最大的伸長量2.5 cm。1.5 mmol/L處理和2.0 mmol/L處理的不定芽生長比較緩慢，分別在20 d和25 d的時候達到各自的最大伸長量2.5 cm和2.0 cm。

2.5 NaN3處理對西瓜生根的影響

不定芽在伸長培養(yǎng)基上伸長培養(yǎng)后，轉到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，統(tǒng)計生根培養(yǎng)所需時間。低濃度的NaN3處理對根的生長有輕微的抑制作用，高濃度的NaN3處理不僅延長了生根時間，而且也抑制了根的伸長，如1.5 mmol/L處理和2.0 mmol/L處理在第 25 d時根長分別是 2.5 cm和 2.0 cm。而 0.5 mmol/L處理和1.0 mmol/L處理根的伸長量分別在19 d和22 d的時候已達到3.5 cm。

3 小結與討論

磷酸緩沖液對伊選的胚根伸長、子葉開展、不定芽分化和生根所需時間以及幼苗的形態(tài)建成基本沒有影響，經過磷酸緩沖液處理后產生的幼苗、分化的不定芽以及生根后的幼苗在生理形態(tài)上和未做任何處理的對照基本一致，兩者之間不存在顯著差異。鄭蔚虹等[2]用7．5 mmol/L，pH值5．8的磷酸緩沖液浸番茄種子5 h，結果促進了番茄種子萌發(fā)和幼苗生長，而且幼苗在受低溫脅迫[（5±1）℃，48 h]時，磷酸緩沖液能有效地降低相對電導率、減緩MDA的積累，減輕膜質過氧化作用，穩(wěn)定膜系統(tǒng)的結構與功能，促進脯氨酸積累，從而提高番茄幼苗的抗冷性。然而在本試驗中，磷酸緩沖液浸種對西瓜種子萌發(fā)和幼苗生長基本沒有影響，和未作任何處理的對照之間差異不顯著。

0.5 mmol/L的NaN3溶液處理對胚根的伸長、子葉的開展、不定芽的分化、不定芽/外植體數(shù)、不定芽的伸長和生根影響輕微，與對照CK1和CK2沒有顯著性差異。1.0 mmol/L和1.5 mmol/L的NaN3溶液處理對胚根伸長、子葉開展、不定芽分化、不定芽/外植體數(shù)、不定芽伸長和生根影響顯著，顯著的延遲了胚根發(fā)生、子葉開展、不定芽分化、伸長以及生根的時間，降低了芽分化的頻率和不定芽/外植體數(shù)，如1.0 mmol/L處理和1.5 mmol/L處理，分別使再生頻率降低到46.7%和40.0%，不定芽數(shù)/外植體分別降低到4.7和4.3。2.0 mmol/L NaN3處理對芽分化、芽伸長和生根都有很強的抑制作用，芽分化時間變長，外植體分化頻率降低，每個外植體芽分化個數(shù)減少，褐化和玻璃化的外植體個數(shù)增加，分化的不定芽較矮小和緊湊，分化的不定芽在伸長和生根培養(yǎng)基上生長不良，表現(xiàn)為葉皺縮，變細，分枝增多，生長緩慢或停滯等。

張?zhí)m等[3]用疊氮化鈉對蘋果葉片進行誘變處理，研究發(fā)現(xiàn)疊氮化鈉對葉片再生有明顯影響，其存活率、再生率和再生芽數(shù)均比對照有所下降。張超美[4]的研究也表明，疊氮化鈉對小麥幼苗生長有抑制作用，在萌發(fā)初期主要表現(xiàn)為對種子啟始萌發(fā)的延滯效應，且延滯時間隨處理濃度升高而相應延長；且隨著溶液濃度遞增，發(fā)芽勢和出苗率也依次下降，并明顯的抑制了幼苗生長。本試驗中，我們也觀察到了類似的現(xiàn)象，隨著疊氮化鈉濃度的升高，西瓜種子萌發(fā)時間明顯延遲，2個對照在第2 d時胚根已有5 mm左右，而當NaN3濃度為2.0 mmol/L時，胚根在前4 d基本沒有伸長，到第6 d時胚根伸長也僅僅只有1.5 mm。當NaN3濃度變?yōu)?.0 mmol/L時，伊選的發(fā)芽率和成苗率則分別驟降到30.0%和33.3%。相對1.5 mmol/L，發(fā)芽率和成苗率同比分別下降47.1%和70%，其發(fā)芽時間和子葉開展時間也相應延后。1.5 mmol/L處理和2.0 mmol/L處理，分別使再生頻率降低到40.0%和33.3%，每個外植體平均分化的不定芽數(shù)分別降低到4.3個和3.4個。與對照CK1和CK2的再生頻率100%和每個外植體平均分化的不定芽數(shù)7.8個相比，差異極顯著。

[1]張全美.西瓜高效植株再生體系建立及四倍體離體誘導研究[D].杭州：浙江大學，2004.

[2]鄭蔚虹，張東向，張曉兵，等.磷酸緩沖液浸種對番茄幼苗抗冷性的影響[J].齊齊哈爾師范學院學報：自然科學版，1997，17（3）：53－55.

[3]張?zhí)m，孫建設，劉國榮.NaN3在蘋果砧木組培苗誘變耐鹽篩選中的應用[J].河北農業(yè)大學學報，2002（25）：108-110.

[4]張超美.疊氮化鈉對小麥的誘變效應[J].湖北農學院學報，1994，14（3）：56－60．

Study on the Direct Regeneration System of Watermelon under the Treatment of NaN3

YANG Guozhi1,ZHANG Mingfang2,GU Zhanggen1,GOU Yanxia3
(1.Jiaxing Academy of Agricultural Sciences,Zhejiang 314016;2.Department of Horticulture,Zhejiang University; 3.Huhehaote Vocational Technical College)

Pure watermelon inbred line"Yixuan"was used in this experiment,the effects of NaN3on the direct regeneration system of watermelon was studied.The results showed that with the increase of NaN3concentration,the time of germination,radicle elongation,cotyledon extending,adventitious bud differentiation and elongation,and root regeneration was deferred distinctly;the percentage of adventitious bud differentiation and the ratio of adventitious bud differentiation per explant was lowered too.The best concentration for inducing chilling resistant mutant in"Yixuan"was 1.5 mmol/L,which decreased the frequency of explant regeneration to 40.0%,and the adventitious buds per explant to 4.3.It is accorded with the requirement ofLD50for chilling resistant mutant.

Chemical mutagenesis;NaN3;Adventitious bud differentiation;LD50

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.004

楊國志（1979-），男，碩士，主要從事西瓜、甜瓜育種研究，電話：13957346489。E-mail:gzhyang99@126.com

2009-02-03