李　捷　陳衛(wèi)昌　屠惠明　吳玉玉　高瑋紅

摘 要 目的：研究大腸腺癌、大腸腺瘤和癌旁正常組織中Raf-1蛋白激酶和VEGF的表達(dá)及其臨床意義。方法：收集72例大腸腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本共112份，其中取自癌組織72份，癌旁正常組織40份，收集40例大腸腺瘤患者的腸鏡下切除標(biāo)本，采用免疫組化法檢測(cè)其Raf-1蛋白激酶及VEGF的表達(dá)。結(jié)果：72例大腸腺癌組織中，Raf-1蛋白激酶的陽(yáng)性表達(dá)率為29.17%，VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率為41.67%，40例大腸腺瘤組織中，Raf-1蛋白激酶陽(yáng)性表達(dá)率為12.50%，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為22.50%，40例癌旁正常組織中，Raf-1蛋白激酶陽(yáng)性表達(dá)率為2.50%，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為10.00%，大腸腺癌Raf-1蛋白激酶及VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于大腸腺瘤組織和癌旁正常組織(P<0.05)；大腸腺癌中Raf-1蛋白激酶的表達(dá)與患者的年齡、性別、病灶大小、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶浸潤(rùn)深度及Dukes分期均無(wú)關(guān)(P>0.05)；大腸腺癌中VEGF的表達(dá)與患者的年齡、性別、病灶大小、分化程度均無(wú)關(guān)(P>0.05)，但與腫瘤有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶浸潤(rùn)深度及Dukes分期均密切相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：Raf-1蛋白激酶及VEGF對(duì)大腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用，但Raf-1蛋白激酶在判斷大腸腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移方面的意義尚不肯定。VEGF 與大腸腺癌的血管生成密切相關(guān)，對(duì)大腸腺癌的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移具有肯定的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 Raf-1蛋白激酶 VEGF 大腸腺癌 大腸腺瘤

中圖分類(lèi)號(hào)：R57

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1006-1533(2009)02-0073-03

大腸癌是胃腸道常見(jiàn)惡性腫瘤，半數(shù)以上來(lái)自腺瘤癌變，從形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)到細(xì)胞增生、腺瘤形成及癌變各階段相應(yīng)的染色體改變，現(xiàn)已證實(shí)其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段及多基因參與的異質(zhì)性疾病^[1]。本研究采用免疫組化方法，檢測(cè)并初步分析Raf-1蛋白激酶及VEGF在大腸腺癌、癌旁正常組織、大腸腺瘤中的表達(dá)及其臨床意義，以探討Raf-1蛋白激酶及VEGF的表達(dá)在大腸腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集無(wú)錫第四人民醫(yī)院2006年1月1日至12月31日腫瘤外科住院患者行手術(shù)治療的72例大腸腺癌患者的切除標(biāo)本共112份，其中癌組織72份，非癌腸組織40份(距癌腫邊緣5 cm以外取材)，其中男性46例，女性26例，年齡36~70歲。參照1990年世界衛(wèi)生組織推薦的分化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，低分化腺癌32例，中、高分化腺癌40例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例；并根據(jù)患者臨床資料及病理資料判斷術(shù)后Dukes分期：A期19例，B期24例，C期24例，D期5例。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放療及化療。另收集同期無(wú)錫第四人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡室對(duì)住院及門(mén)診患者進(jìn)行腸鏡下大腸息肉樣病灶高頻電切除術(shù)所得標(biāo)本且經(jīng)病理診斷明確為腺瘤者40例，其中男性24例，女性16例，年齡31~68歲。

1.2 免疫組化檢測(cè)

鼠抗人VEGF單克隆抗體工作液(JH121)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。鼠抗人Raf-1單克隆抗體濃縮液(PS338[DPR/2/2A/3A])購(gòu)自L(fǎng)ab Vision公司。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 陽(yáng)性結(jié)果判定

免疫組化染色陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃或棕褐色。Raf-1蛋白激酶表達(dá)按所購(gòu)試劑說(shuō)明書(shū)要求以人扁桃體組織切片為陽(yáng)性對(duì)照片，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液替代第一抗體所得組織切片表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)。VEGF以細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒為陽(yáng)性，高倍鏡下(400倍)對(duì)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野，共計(jì)1 000個(gè)，陽(yáng)性細(xì)胞率≤10%計(jì)為陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞率>10%為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，不同組織間Raf-1蛋白激酶和VEGF表達(dá)差異及Raf-1蛋白激酶和VEGF表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)間關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)及Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸腺癌、大腸腺瘤及癌旁正常組織中的Raf-1蛋白激酶和VEGF表達(dá)

72例大腸腺癌組織中，Raf-1蛋白激酶陽(yáng)性表達(dá)率為29.17%(21/72)，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為41.67%(30/72)，40例大腸腺瘤組織中，Raf-1蛋白激酶陽(yáng)性表達(dá)率為12.50%(5/40)，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為22.50%(9/40)。40例癌旁正常組織中，Raf-1蛋白激酶陽(yáng)性表達(dá)率為2.50%(1/40)，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為10.00%(4/40)。大腸腺癌與大腸腺瘤、大腸腺癌與癌旁正常組織中的Raf-1蛋白激酶和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。大腸腺瘤與癌旁正常組織中的Raf-1蛋白激酶和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 Raf-1蛋白激酶和VEGF表達(dá)與大腸腺癌不同臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Raf-1蛋白激酶在大腸腺癌中表達(dá)與患者的年齡、性別、病灶大小、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶浸潤(rùn)深度是否突破漿膜層及Dukes分期(比較A+B期和C+D期)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；VEGF在大腸腺癌中表達(dá)與患者的年齡、性別、病灶大小、分化程度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但與大腸腺癌病灶有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶浸潤(rùn)深度是否突破漿膜層及Dukes分期(比較A+B期和C+D期)均有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

大腸癌的組織發(fā)生有以下兩種方式：1)從腺瘤演變?yōu)榘聪倭?癌順序。2)從正常黏膜或炎癥黏膜發(fā)展為癌，即de novo癌。近年來(lái)大量的流行病學(xué)、病理學(xué)和遺傳學(xué)等研究也均支持大腸腺瘤是大腸癌的主要癌前狀態(tài)的觀點(diǎn)，目前認(rèn)為，80%以上的大腸癌系由大腸腺瘤演變而來(lái)^[2]。因此，腺瘤惡變?cè)诖竽c癌的發(fā)生中有重要意義。在大腸腺瘤惡變的過(guò)程中，RAS基因、APC基因、DCC基因、MCC基因和P53基因的突變起較關(guān)鍵的作用，而Raf蛋白激酶作為RAS基因的下游效應(yīng)分子，通過(guò)MAPKs途徑，在大腸腺瘤癌變的過(guò)程中起了重要的促進(jìn)作用。

Sun Y等^[3]研究認(rèn)為，在大腸癌形成過(guò)程中，Raf-1蛋白激酶表達(dá)增高，MAPKs通路持續(xù)激活，抑制了大腸癌SW480和Colo-205細(xì)胞的P21琖AF1和P27琄IP1等抑癌基因的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞周期由G1/G0到S期(DNA合成期)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致未修復(fù)的受損基因和癌基因大量合成、聚集，刺激腸黏膜細(xì)胞異型增生而導(dǎo)致大腸腺瘤和大腸癌形成。

在本研究中，大腸腺癌及大腸腺瘤組織中Raf-1蛋白激酶的表達(dá)均高于癌旁正常組織，且大腸腺癌組織中Raf-1蛋白激酶的表達(dá)明顯高于大腸腺瘤組織，提示其高活性表達(dá)可能與刺激腸黏膜上皮腺瘤形成，并最終導(dǎo)致腺瘤惡變有關(guān)。但研究提示，Raf-1蛋白激酶在大腸腺癌組織中的表達(dá)與Dukes 分期、病灶浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系不大。

VEGF在體內(nèi)有誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、增強(qiáng)血管通透性的作用。在腫瘤形成過(guò)程中，VEGF直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受體，能增加微血管特別是毛細(xì)血管和小靜脈的通透性，促進(jìn)血漿纖維素外滲，為血管形成過(guò)程中的細(xì)胞遷移提供一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)，從而有利于腫瘤細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移^[4]。纖維蛋白原和血漿纖維連接蛋白在腫瘤間質(zhì)中積聚，高度特異地選擇性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘發(fā)組織因子、膠原酶產(chǎn)生，從而誘發(fā)新生血管形成和腫瘤生長(zhǎng)^[5，6]。豐富的新生血管形成不僅增加了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)的機(jī)會(huì)，而且腫瘤細(xì)胞還可以侵入與毛細(xì)血管伴行的鄰近淋巴管，或通過(guò)淋巴靜脈連接進(jìn)入淋巴管，促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移。VEGF與淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上的受體Fit-4結(jié)合后，可通過(guò)MEK/ERK和PI3-激酶/Akt途徑引起發(fā)育中的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移及抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮促淋巴管新生的作用^[7，8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在大腸腺癌及大腸腺瘤組織中的表達(dá)均較癌旁正常組織明顯增高，且在大腸腺癌組織中VEGF表達(dá)明顯高于大腸腺瘤組織，VEGF的表達(dá)與大腸腺癌Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，與劉強(qiáng)等^[9～11]近年來(lái)報(bào)道的大腸癌組織中VEGF的表達(dá)情況一致。研究表明，VEGF 與新生血管形成有關(guān)，通過(guò)促進(jìn)新生血管形成而促進(jìn)大腸癌的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，VEGF 可成為反映大腸癌生物學(xué)行為的客觀指標(biāo)。

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(收稿日期：2008-10-24)