魯恒星　華朝陽

摘要以高中生物教材為切入點(diǎn)，以諾貝爾化學(xué)獎為背景，從來源、分子結(jié)構(gòu)、發(fā)光機(jī)制、研究歷程以及在生物技術(shù)中的應(yīng)用等方面對綠色熒光蛋白進(jìn)行了概述。

關(guān)鍵詞熒光現(xiàn)象綠色熒光蛋白熒光標(biāo)記

中圖分類號Q-49文獻(xiàn)標(biāo)識碼E

現(xiàn)行高中生物教科書(人教版)中，多處描述了熒光標(biāo)記技術(shù)，并有有關(guān)熒光蛋白的描述，如熒光標(biāo)記的小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞融合實驗、熒光標(biāo)記技術(shù)與基因定位、熒光鼠的培育等。2008年10月8日，瑞典皇家科學(xué)院把今年的諾貝爾化學(xué)獎授予綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者和推廣者。于是，筆者搜集并整理了有關(guān)資料，從綠色熒光蛋白(GFP)的來源、分子結(jié)構(gòu)、發(fā)光機(jī)制、研究歷程以及在生物技術(shù)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行概述。

12008年諾貝化學(xué)獎及獲獎?wù)吆喗?/p>

日本的下村修、美國的馬丁·沙爾菲和美籍華人錢永健于2008年10月8日，因?qū)G色熒光蛋白(GFP)的研究，分享了今年的諾貝爾化學(xué)獎。他們的研究歷程，猶如一場接力跑：下村修發(fā)現(xiàn)了GFP，沙爾菲確定了它的應(yīng)用價值；而錢永健則讓它變得多樣化。

下村修現(xiàn)年80歲，生于京都，長于長崎。1960年獲得名古屋大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位后赴美，先后在美國普林斯頓大學(xué)、波士頓大學(xué)和伍茲霍爾海洋生物實驗所工作。1962年他發(fā)現(xiàn)熒光蛋白，被譽(yù)為生物發(fā)光研究第一人。從33歲做出重要發(fā)現(xiàn)，到46歲完成全部關(guān)鍵實驗，他的研究遙遙領(lǐng)先，卻一直默默無聞。2001年退休后，年逾七旬的下村修繼續(xù)在家里的地下室潛心研究。

馬丁·沙爾菲現(xiàn)年61歲，美國哥倫比亞大學(xué)生物學(xué)教授，他在利用綠色熒光蛋白做生物示蹤分子方面做出貢獻(xiàn)。

錢永健1952年出生于美國紐約，現(xiàn)為美國加州大學(xué)圣迭戈分校生物化學(xué)及化學(xué)系教授、美國國家科學(xué)院院士、國家醫(yī)學(xué)院院士，2004年沃爾夫獎醫(yī)學(xué)獎得主。他發(fā)明的多色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)，將為細(xì)胞生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)發(fā)展帶來一場革命。

2熒光現(xiàn)象

一些化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學(xué)能、x線或陰極射線等)而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式散失(即發(fā)光)，這種現(xiàn)象就是熒光現(xiàn)象?？僧a(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光。而一旦停止供能，發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨之瞬間消失。

3綠色熒光蛋白(GFP)的來源、分子結(jié)構(gòu)和發(fā)光機(jī)制

綠色熒光蛋白最初在海洋無脊椎動物——維多利亞多管水母中被發(fā)現(xiàn)。野生型的GFP的分子量約為27kD，單鏈，由238個氨基酸殘基組成。GFP具典型的β桶形結(jié)構(gòu)，包含β折疊和α螺旋，由周圍11個β-折疊片圍繞中央1個α-螺旋構(gòu)成，發(fā)光中心位于中央的α-螺旋結(jié)構(gòu)中，嚴(yán)密的桶形結(jié)構(gòu)保護(hù)著發(fā)光中心，防止它被周圍環(huán)境淬滅。GFP的發(fā)光中心由六肽組成，發(fā)光團(tuán)是其中的Ser65-Tyr66-Gly67三個氨基酸殘基經(jīng)過環(huán)化、脫氫后形成的咪唑環(huán)。發(fā)光中心周圍的殘基與發(fā)光中心相互作用對GFP發(fā)光產(chǎn)生影響。GFP這種堅實的結(jié)構(gòu)保證了其穩(wěn)定和抗熱、抗變性的特點(diǎn)。GFP的真正的發(fā)光部位為咪唑環(huán)上的陰離子酚，Tyr66的脫質(zhì)子(酚鹽)和質(zhì)子化狀態(tài)(羥酚基)的轉(zhuǎn)換決定熒光發(fā)射。野生型GFP有2個吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，兩種波長的任何一種光激發(fā)均可使GFP產(chǎn)生509nm的綠色熒光。

盡管野生型GFP能發(fā)出很絢麗的熒光，但它還是有不少缺點(diǎn)，比如有兩個激發(fā)峰、光穩(wěn)定性不好，在37℃不能正確折疊等。研究人員通過定點(diǎn)或隨機(jī)突變，不斷地改造發(fā)光基團(tuán)周圍的殘基，得到了多種改良型的GFP。S65T點(diǎn)突變獲得的GFP，光譜性質(zhì)顯著提高，熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)，激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488nm，而發(fā)射峰仍保持在509nm，使GFP的應(yīng)用潛力得到有效提高；F64L點(diǎn)突變獲得的GFP，在37℃的折疊能力得到改善；顏色突變獲得多色熒光蛋白，如藍(lán)色熒光蛋白、青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白；另外，還獲得了對pH敏感的突變體等。目前，GFP家族已經(jīng)變得絢麗多彩。

4綠色熒光蛋白的研究歷程

GFP發(fā)光不同于螢火蟲發(fā)光，螢火蟲是由熒光酶催化底物分子——熒光素以后產(chǎn)生熒光；而GFP發(fā)光是蛋白質(zhì)本身發(fā)光，無需底物。之前就有人研究生物發(fā)光現(xiàn)象，蛋白質(zhì)本身發(fā)光的研究則源于下村修和約翰森的發(fā)現(xiàn)。

1955年，有人發(fā)現(xiàn)水母可以發(fā)綠光，但不知其因。1962年，下村修和約翰森從水母中分離生物發(fā)光蛋白——水母素時，意外地發(fā)現(xiàn)了一個副產(chǎn)物——GFP，它在陽光下呈綠色、鎢絲下呈黃色、紫外光下發(fā)強(qiáng)烈綠色。1974年，他們得到了這種蛋白質(zhì)。GFP在水母中之所以能發(fā)光，是因為水母素在鈣刺激下發(fā)光，其能量可轉(zhuǎn)移到GFP，刺激GFP發(fā)光。這是物理化學(xué)中已知的熒光共振能量轉(zhuǎn)移在生物中的發(fā)現(xiàn)。水母素是熒光酶的一種，它需要熒光素才能發(fā)光，而GFP是蛋白質(zhì)本身發(fā)光，在原理上有重大突破。

下村修做GFP研究時只是對生物發(fā)光好奇，而對GFP的應(yīng)用前景不感興趣，也沒有意識到應(yīng)用的重要性。1992年，有人拿到了水母素和GFP的cDNA。有了基因序列，很多人嘗試將GFP表達(dá)到其他生物體中，但都失敗了。1994年沙爾菲利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了GFP的編碼區(qū)，成功地將它克隆到大腸桿菌和線蟲細(xì)胞中，通過紫外線或藍(lán)光激發(fā)，均產(chǎn)生了很美妙的綠色熒光。首次證實了GFP作為發(fā)光標(biāo)記物用于生物學(xué)研究的價值，這才是GFP作為熒光指示劑的真正突破。

沙爾菲的研究立即引起轟動，許多生物學(xué)研究者紛紛將GFP引入自己的研究對象。從1961年到1974年，下村修和約翰森的研究遙遙領(lǐng)先但很少有人注意。在1974年以后的后繼工作，主要是跟風(fēng)研究，其中例外的是錢永健的工作。

1994年，錢永健通過定點(diǎn)或隨機(jī)突變，首次完成對GFP發(fā)光基團(tuán)周圍殘基的重大改造，從而改進(jìn)了GFP的發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光顏色，使GFP家族變得絢麗多彩。目前，世界上使用的熒光蛋白大多是錢永健實驗室改造后的變種。他發(fā)明了更多應(yīng)用方法，闡明了發(fā)光原理。

5應(yīng)用與展望

GFP在多種條件下穩(wěn)定，分子量??；GFP基因序列較短，可以與其他基因一起構(gòu)建到載體上進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化；GFP基因沒有物種特異性，在原核、酵母、植物以及動物細(xì)胞中都獲得了成功表達(dá)，大量表達(dá)對細(xì)胞沒有毒性；GFP熒光穩(wěn)定，適用于定量測定與分析。GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，通過常規(guī)的基因操縱手段，用熒光蛋白來標(biāo)記目標(biāo)蛋白，可跟蹤和判斷生物細(xì)胞的分子變化。因此人們將綠色熒光蛋白喻為生物化學(xué)中的“北斗星”。21世紀(jì)初，在它的指引下，人們深入到大片未知的科學(xué)處女地，看到了以前所不能見的新世

界，研究成果層出不窮。

5.1目標(biāo)蛋白的位置及動態(tài)變化的觀察

利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)入合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后通過熒光顯微鏡，借助閃閃發(fā)光的標(biāo)簽工具(GFP)便能觀察到令人感興趣的、通常肉眼看不見的蛋白的運(yùn)動、定位及它們之間的互動。利用這項技術(shù)科學(xué)家已經(jīng)加深了對細(xì)胞細(xì)胞分裂、染色體復(fù)制和分裂，發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程的了解。其中，做得最漂亮的當(dāng)屬“腦虹”實驗，即對3種不同顏色的GFP加以調(diào)配，變成6種顏色，然后將它們分別“轉(zhuǎn)移”給不同神經(jīng)細(xì)胞，用以觀察它們的生長過程及其相互關(guān)系。一些實驗室甚至“生產(chǎn)”出了可人為控制顏色的熒光魚、熒光鼠、熒光豬等。

5.2細(xì)胞器的標(biāo)記

GFP在接上各種細(xì)胞內(nèi)定位序列后，在活體中可直接觀察各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其生活狀態(tài)。已有大量實驗報道表明GFP可定位到細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜及核膜孔等。各種基因突變體的產(chǎn)生也使得定位在很小區(qū)域內(nèi)的GFP能很靈敏地被檢測到。同樣，利用GFP能在各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中表達(dá)的特性可以研究某些序列的定位特性及分析定位序列的結(jié)構(gòu)特征等。

5.3DNA標(biāo)記

GFP除了可標(biāo)記蛋白質(zhì)外，也可用于標(biāo)記DNA。細(xì)菌lae阻遏蛋白(laeI)能與它的目標(biāo)DNA(lae操縱子，lacO)緊密和特異結(jié)合，用GFP與laeI可構(gòu)建產(chǎn)生laeI-GFP，將laeO序列插入到細(xì)胞的基因組中，然后在活細(xì)胞中可直接觀察laeI-GFP與laeO的共定位地點(diǎn)，利用這種技術(shù)已成功地在哺乳動物細(xì)胞、酵母及細(xì)菌中活體標(biāo)記了DNA序列。

5.4分析病原物與宿主關(guān)系

傳統(tǒng)方法必須在分析前對組織進(jìn)行處理，但這樣就阻止了感染的繼續(xù)進(jìn)行。GFP的出現(xiàn)可有效地克服這一弊端。研究表明，移動蛋白MP對病毒的細(xì)胞間移動是絕對必需的。將GFP與TMV(煙草花葉病毒)的MP融合，可用來跟蹤MP在亞細(xì)胞間的移動、監(jiān)測MP分子與宿主蛋白的關(guān)系及分離與之相互作用的成分等。運(yùn)用這種方法人們可以跟蹤病原物對宿主的感染途徑，研究病原物與宿主的相互關(guān)系、藥物的作用情況等。

5.5藥物篩選

新發(fā)展的光學(xué)分析方法已經(jīng)開始利用活體細(xì)胞來進(jìn)行藥物篩選，這一技術(shù)能從數(shù)量眾多的化合物中快速篩選出科學(xué)家所感興趣的藥物。在細(xì)胞內(nèi)分子之間的相互作用非常復(fù)雜，其中很多涉及到信號分子與某受體結(jié)合后的遷移，而這一遷移過程通常與細(xì)胞的某生理功能有關(guān)。因而，這些受體常常被用作藥物篩選的目標(biāo)，若某一藥物具有與信號分子類似的功能，那么該藥物即具有潛在的醫(yī)藥價值。利用GFP熒光探針，將很容易從數(shù)量眾多的化合物中判斷哪些化合物具有與信號分子相似的功能，且這一篩選過程簡單方便，所需成本也很低。

5.6融合抗體

近20年來，抗體生成技術(shù)有了飛速發(fā)展，已經(jīng)從細(xì)胞工程抗體(雜交瘤技術(shù)——單克隆抗體)發(fā)展到了第三代抗體：基因工程抗體。融合抗體屬基因工程抗體，它具有與抗原結(jié)合及發(fā)射熒光兩種特性，由于技術(shù)上的的原因，一般融合抗體均置于原核表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌中表達(dá)。若能成功解決其表達(dá)問題，則融合抗體將在免疫染色及腫瘤檢測這一領(lǐng)域扮演極為重要的角色。

5.7生物傳感器

利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)將一具有信號傳導(dǎo)功能分子識別位點(diǎn)的分子結(jié)合到另一分子上可以設(shè)計生物感受器。綠色熒光蛋白以其獨(dú)特的光信號傳導(dǎo)機(jī)制，以及在表達(dá)后易被周圍化學(xué)環(huán)境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適于用做活細(xì)胞體內(nèi)的光學(xué)感受器。第一個基于GFP的生物感受器為Ca²感受器，原理是利用鈣調(diào)蛋白結(jié)合鈣離子后引起的空間構(gòu)象變化導(dǎo)致兩種GFP突變體間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。但是由于大多數(shù)蛋白不能像鈣調(diào)蛋白那樣承受較大的空間構(gòu)象變化，為克服這一缺點(diǎn)，人們開始提出利用基因融合技術(shù)將一新的分子識別位點(diǎn)結(jié)合到GFP上以構(gòu)建新的分子感受器。將受體蛋白插入到GFP表面的技術(shù)已經(jīng)成為構(gòu)建分子感受器的有力工具。將來，GFP感受器能被用來檢測多種分子，如蛋白質(zhì)、核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應(yīng)用前景極為廣闊。

不過熒光蛋白也存在著一些不足，主要表現(xiàn)在GFP從表達(dá)到成為具有熒光活性形式的過程比較慢，因而對某些細(xì)胞動力學(xué)過程不能實時監(jiān)測，檢測的靈敏度也需要進(jìn)一步提高，某些細(xì)胞的螢光背景會影響GFP的檢測。但隨著對GFP研究的深入，預(yù)計將會有更多突變改進(jìn)型的GFP出現(xiàn)，可以逐步克服上述的一些缺點(diǎn)，推動GFP在生命科學(xué)研究中更廣泛的應(yīng)用。21世紀(jì)是生物學(xué)世紀(jì)，在綠色熒光蛋白與其他技術(shù)變革的共同推動下，這個預(yù)言將真正有可能成為現(xiàn)實。