孫　靜　巫志峰　韓　凌

【摘要】 應(yīng)用微量序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Micro-PCR-SSP），探討我國(guó)廣東籍漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）與HLA-DQB1基因的相關(guān)性。對(duì)38例SLE患者和110例正常對(duì)照者的血樣進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)表明，SLE患者DQB1*0601等位基因頻率顯著升高（RR＝2．19，P=0．0055），可能是易感基因，而DQB1*0301與DQB1*0401基因頻率則顯著降低（ DQB1*0301，RR＝0．1253，P=0．0001; DQB1*0401，RR＝0，P＝0．0409），可能為保護(hù)基因。

【關(guān)鍵詞】HLA-DQB1等位基因；系統(tǒng)性紅班狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，常累及多個(gè)臟器，發(fā)病有一定的遺傳傾向。人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng)（human leukocyte antigens，HLA）是一組組成和結(jié)構(gòu)都有非常復(fù)雜的基因復(fù)合體，HLA最主要的特點(diǎn)是具有高度多態(tài)性，特別是在HLA-Ⅱ類基因的第二外顯子區(qū)，這種多態(tài)性更為明顯。與SLE有關(guān)的主要是HLA-Ⅱ類基因^[1]，HLA-Ⅱ類基因座在HLA-D區(qū)，包括HLA-DQ、DR、DP三個(gè)亞區(qū)，已知HLA-DQ的多態(tài)性與SLE自身抗體的產(chǎn)生關(guān)系最密切^[2]。本中心實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用微量序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Micro-PCR-SSP）從分子遺傳學(xué)角度，探討HLA-DQB1與廣東漢族人SLE患者的遺傳易感性關(guān)系。

1 材料和方法

1．1 研究對(duì)象 擬選廣東籍漢族SLE患者38例，SLE患者均符合1992年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取連續(xù)三代均為廣東籍無(wú)親緣關(guān)系的健康者100例作為對(duì)照組，與患者無(wú)血緣關(guān)系。

1．2 標(biāo)本采集 抽取SLE患者與正常人靜脈血各2 ml，ACD-B抗凝。

1．3 試劑

1．3．1 引物設(shè)計(jì) 按文獻(xiàn)^[3]合成28條核苷酸鏈，組成20對(duì)引物。

1．3．2 Taq酶購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1．3．3 DNA抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。

1．4 基因組DNA的制備 取2 ml ACD-B抗凝全血3000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，吸取200 μl白膜層加入1．5 ml離心管中，加入25 μl QIAGEN蛋白酶K和200 μl AL緩沖液，混勻15 s，70℃孵育10 min，然后加入200 μl無(wú)水乙醇混勻，將上述混合液轉(zhuǎn)至DNA親和柱上，離心10 000轉(zhuǎn)/min 1 min，去除濾過(guò)液，在柱上加入500 μl AW1緩沖液，離心1 min，再加入AW2緩沖液，重復(fù)洗滌一次，然后加入200 μl的AE緩沖液，室溫孵育5 min，最后離心1 min洗脫DNA，并測(cè)定DNA的濃度和純度。

1．5 DNA擴(kuò)增在SSP-PCR反應(yīng)體系中，每一DNA均作20支反應(yīng)管，每管反應(yīng)液50 μl，含25 μmol/L dNTP,10×PCR緩沖液1．5 μl，MgCL 21．5 mmol/L，Taq酶1 U，模板DNA 50~100 ng，等位基因?qū)Ｒ恍砸锔?．25 μmol/L。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃1 min預(yù)變性，然后94℃ 30 s、60℃30 s、72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)至2%瓊脂糖凝膠微量膠內(nèi)，125伏電壓電泳15 min，然后在凝膠一次性成像儀上觀察并拍照。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率。用Fisher精確法統(tǒng)計(jì)P值和相對(duì)危險(xiǎn)度（RR）。顯著檢驗(yàn)水平為0．05。

2 結(jié)果

從表中可以看出，與正常對(duì)照組相比，SLE患者組中DQB1*0601等位基因頻率顯著升高（RR＝2．19，P=0．005 5），而DQB1*0301與DQB1*0401基因頻率則顯著降低（ DQB1*0301，RR＝0．1253，P=0．000 1; DQB1*0401，RR＝0，P＝0．040 9）。

3 討論

人類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)含128個(gè)功能基因，其中39．8%的基因和免疫系統(tǒng)有關(guān)，因此39．8%基因可能與許多免疫疾病的發(fā)生直接或者間接相關(guān)^[4]。近年來(lái)國(guó)外的許多研究資料表明，在遺傳因素方面，SLE與HLA基因的遺傳易感性關(guān)系存在著種族和人群差異的影響，尤其DQ位點(diǎn)的作用引人注目。筆者通過(guò)應(yīng)用PCR-SSP技術(shù)獲得了廣東正常人群和SLE患者基因頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE患者DQB1*0601等位基因頻率較正常人顯著升高，提示DQB1*0601可能是SLE的易感基因，而正常人DQB1*0301與DQB1*0401的等位基因頻率顯著升高。在高加索人種的SLE患者中，HLA-DQB1易感基因可能是DQB1*0602，*0602和*0301；保護(hù)基因可能是DQB1*0501；在日本SLE患者中，易感基因可能是DQB1*0602。這些研究結(jié)果與筆者對(duì)廣東SLE患者的研究結(jié)果存在明顯差異。而國(guó)內(nèi)陳躍華^[5]等分析中國(guó)漢族人群HLA-DQ基因多態(tài)性與SLE的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)等位基因DQA1*0102、DQB1*0601是中國(guó)漢族人群SLE患者的危險(xiǎn)基因（P<0．05）,而等位基因DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401與DQB1*0503是中華漢族人群SLE患者的保護(hù)基因，這與筆者的研究結(jié)果較為一致，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了HLA-DQB1基因在SLE患者中的分布存在著地區(qū)和種族的差異。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ 楊穎，熊平，魏承洪，等．HLA-DRB1等位基因與中國(guó)湖北漢族人SLE關(guān)聯(lián)的研究．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1996，16(5)：340-342.

［2］ 彭學(xué)標(biāo)，費(fèi)虹明，岳曉玉，等．HLA-DR、DQ基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的研究．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1997，17(6)：438-441.

［3］ O Olrup，A Aldener，A.fogdell.HLA-DQB1 and-DQA1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers(PSR-SSP) in 2 hours.Tissue Antigens，1993,41:119-134.

［4］ 謝尚葵，馮樹(shù)芳，沈福民，等．系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床表現(xiàn)與HLA-Ⅱ類單倍型關(guān)聯(lián)的研究．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2000，20(1)：66-69.

［5］ 陳躍華，陳明，范昌斌,等.中國(guó)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡與HLA-DQ基因多態(tài)性的Meta分析.安徽醫(yī)學(xué)，2006,（3）:175-177.