林　琳　李冬松　陶　春　湯文麗　呂　品　劉月英　宋寶華　寶魯爾

【摘要】 目的 通過對大鼠實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的觀察，對缺血缺氧造成的腦損傷機制進行探討。方法 用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)檢測大鼠SAH后CVS時海馬組織Bcl-2和Bax mRNA的表達變化。結(jié)果 Bcl-2 mRNA的表達水平在蛛網(wǎng)膜下腔組1 d時即開始下降，5~7 d時降至最低。Bax mRNA的表達1 d呈上升趨勢，5~7 d時達最高。在對照組和假手術(shù)組海馬組織內(nèi)的Bcl-2和Bax mRNA的表達水平保持相對恒定。結(jié)論 提示Bcl-2 和Bax可能參與了缺血缺氧所致的神經(jīng)元損傷。

【關(guān)鍵詞】蛛網(wǎng)膜下腔出血；海馬；大鼠；Bcl-2；Bax

Rats subarachnoid hemorrhage after cerebral vasospasm in the hippocampus of Bcl-2 and Bax mRNA expression

LIN Lin，LI Dong-song，TAO Chun，et al.Inner Mongolia National University School of Medicine，Inner Mongolia 028000，China

【Abstract】 Objective Through the rat cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage observation，the hypoxic ischemic brain injury caused by the mechanism discussed.Methods Use reverse transcription-polymerase chain reaction test after SAH CVS rat hippocampus when the Bcl-2 and Bax mRNA expression of.Results Bcl-2 mRNA expression in subarachnoid hemorrhage a day that started to decline,5~7 days to a minimum.Bax mRNA expression of an upward trend，5~7 days to a maximum.In the control group and the sham group within the hippocampus of the Bcl-2 and Bax mRNA expression levels remained relatively constant.Conclusion Bcl-2 and Bax may be involved in the hypoxic ischemic damage caused by the neurons damage.

【Key words】Subarachnoidhemorrhage； Hippocampus；Rats；Bcl-2；Bax

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH），后40%~80%發(fā)生遲發(fā)性腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)^[1]，導(dǎo)致腦缺血和缺氧，嚴重時發(fā)生梗死，成為致死致殘的主要原因^[2]。本實驗采用大鼠枕大池二次注血法建立CVS 動物模型，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)動態(tài)觀察SAH后海馬組織內(nèi)Bcl-2和Bax mRNA的表達變化，并對兩者與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系及其與SAH后CVS導(dǎo)致缺血性腦損傷的機制進行探討，為臨床上有效防治CVS引起的腦損傷提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動物與分組 健康SD大鼠72只，體質(zhì)量380~410 g，雌雄不限，由吉林大學實驗動物中心提供，動物隨機分成9組，正常對照組8只、假手術(shù)組32只和SAH組32只，各組根據(jù)術(shù)后處死時間不同再分為假手術(shù)1、3、5、7 d組和SAH 1、3、5、7 d組，每組各8只大鼠。如下分組：1組：正常對照組；2組：假手術(shù)對照1 d組；3組：SAH 1 d組；4組：假手術(shù)對照3 d組；5組：SAH 3 d組；6組：假手術(shù)對照5 d組；7組：SAH 5 d組；8組：假手術(shù)對照7 d組； 9組：SAH 7 d組。

1．2 試劑 由北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司提供。

從基因文庫中查到大鼠Bcl-x和Bax基因cDNA序列，應(yīng)用Oligo 5．0軟件程序設(shè)計上、下游引物：引物設(shè)計：Bcl-2引物：上游5′-CCGGGAGATCGTGATGAAGT-3′；下游5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3′。Bax引物為：上游5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′；下游5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′。利用上述引物推導(dǎo)的PCR 產(chǎn)物的大小分別為：Bcl-2，376 bp；Bax，284 bp。

1．3 方法

1．3．1 模型建立 10%水合氯醛(0．35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，大鼠俯臥位固定于操作臺上，項部備皮消毒?？v行切開頸部皮膚，暴露枕骨、環(huán)椎及環(huán)枕膜，用注射器針頭刺破環(huán)枕膜到達枕大池，有腦脊液流出后，由左眼球后靜脈叢抽取0．3 ml無抗凝自體血，以0．1 ml/min注射速度緩慢將0．15 ml/100 g的自體不抗凝血注入枕大池。明膠海綿壓迫。將大鼠頭低30°俯臥位30 min，以利血液凝固沉積在腦底血管周圍。大鼠保溫復(fù)蘇至清醒后自由飲食飲水。48 h后同法操作制成大鼠SAH動物模型。假手術(shù)組動物按上述方法在枕大池內(nèi)注入同樣量的生理鹽水2次，對照組只做手術(shù)不注射。在第2次注射后第1，3、5、7天取腦待檢。

1．3．2 標本取材 各時點大鼠均以10%的水合氯醛(0．35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，經(jīng)心臟灌流快速灌入生理鹽水300~400 ml沖洗，右心房流出顏色鮮亮的液體，4%中性多聚甲醛400 ml灌流，打開顱腔，快速取出海馬，-80℃保存。

1．3．3 組織中總RNA提取 采用TRIzol法提取總RNA。取50~100 mg組織/ml Trigol，加入預(yù)冷的Trigol提取液，加入少量液氮充分勻漿，其余步驟嚴格按提取液說明書進行。所得溶解于無NRnase水中，-80℃保存。

1．3．4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 合成第一鏈cDNA具體反應(yīng)體系為：①在40 μl的反應(yīng)體積中總RNA 5 μg；②加入5×緩沖液Bufter 8 μl；③dNTPmixyure 10 ml/U，2 μl；④digo（dT）18，2 μl；⑤AMU 0．5 μl；⑥D(zhuǎn)EPC水補充到50 μl。置室溫10 min，42℃水育1 h，冰水冷卻2 min，合成cDNA，-20℃保存。

1．3．5 PCR擴增 合成的cDNA進行PCR擴增，步驟：①在25 μl反應(yīng)體積中加入cDNA 0．1 μg；②10×PCR 緩沖液（Bufter）2．5 μl；③dNTPmixyure 10 ml/U，2 μl，DNA聚合酶（Takara）2．5 μl；④MgCl2 2．5 μl；⑤各引物0．5 μl；循環(huán)條件：93℃、30 s，55℃、72℃ 1 min，30 s，33個循環(huán)。

1．3．6 Bcl-2、Bax的表達 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進行照相掃描并進行密度分析。

1．3．7 統(tǒng)計學方法 用Labworks 軟件對各陽性條帶的密度進行測量，測得的Bcl-2和Bax 陽性條帶的密度作為其mRNA的表達量。采用SPSS軟件作方差分析，以P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 RT-PCR檢測結(jié)果 用RT-PCR方法在實驗大鼠的海馬組織中檢測到了Bcl-2和Bax mRNA的表達且表達呈規(guī)律性變化，關(guān)系非常密切。在正常對照組大鼠海馬組織中檢測到了Bcl-2和Bax mRNA的表達，凝膠電泳結(jié)果顯示Bcl-2，Bax的PCR擴張片段的位置大小分別為Bcl-2，376 bp；Bax，284 bp（圖1）。與利用各對特異性引物所推導(dǎo)的PCR擴增產(chǎn)物的大小相一致。

2．1．1 海馬組織內(nèi) Bax mRNA 的表達水平 ①正常對照組與假SAH 組Bax mRNA 的表達水平均較低，假SAH 組Bax mRNA 的表達水平與正常組比較無明顯變化（P>0．05）；②SAH組：在SAH 后1 d Bax mRNA的表達不明顯，3 d Bax mRNA的表達開始明顯升高（P<0．05），5~7 d時達最高，以上均顯著高于正常組及同一時間點的假手術(shù)組（P<0．01）。見圖1，表1。

2．1．2 海馬組織內(nèi)Bcl-2 mRNA的表達 ①正常對照組與假手術(shù)組各時間點的Bcl-2 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0．05）；②SAH組Bcl-2 mRNA的表達水平：1 d開始有呈下降趨勢，3 d時即有明顯降低，5 d時降至更低，7 d時最低，與正常對照組及同時間點的假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0．01）。見圖1，表1。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展已證實細胞凋亡是許多疾病的發(fā)病機制。近年來研究顯示，凋亡也是缺血性腦損傷組織遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的顯著特點。蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后誘發(fā)的腦血管痙攣（CVS），導(dǎo)致腦組織不同程度的缺血缺氧損害，發(fā)生了多種物質(zhì)共同參與的腦神經(jīng)組織細胞凋亡，原癌基因B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族是細胞凋亡相關(guān)因素中最受關(guān)注的基因之一。Bcl-2蛋白家族成員在細胞凋亡中起兩種截然相反的作用，一類為促生存家族促生存家族包括Bcl-2、Bak、Bcl-xL等，Bcl-2基因主要定位于線粒體膜、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。另一類為促凋亡家族，包括Bax等。在細胞凋亡的調(diào)控過程中，Bcl-2基因家族的表達蛋白具有重要意義^[3]。研究表明，Bax的過度表達及Bcl-2表達的相對不足是導(dǎo)致SAH后細胞凋亡即造成神經(jīng)損傷的重要環(huán)節(jié)^[4]，細胞凋亡減弱時Bcl-2表達增強，反之凋亡增強時Bcl-2表達減弱而Bax增強^[5]。有人認為^[6]，Bcl-2抑制細胞凋亡作用是與其形成異源二聚體有關(guān)，Bcl-2高表達時，其形成異源二聚體Bcl-2/Bax而抑制調(diào)亡，Bax亦是通過與線粒體上Bcl-2蛋白形成二聚體發(fā)揮作用，Bax高表達時其形成同源二聚體Bax/Bax而誘導(dǎo)凋亡。Bax與Bcl-2的相對比值在決定細胞生存或死亡中也可能起關(guān)鍵性的作用，但它在細胞凋亡過程中發(fā)揮怎樣的作用還不太清楚^[7]。由于海馬區(qū)神經(jīng)元對缺血具有選擇性敏感，所以海馬成為缺血性腦損傷研究的一個典型腦區(qū)^[8]。筆者用枕大池二次注血法建立的SAH大鼠腦血管痙攣模型上，筆者觀察到SAH組動物海馬內(nèi)Bcl-2和Bax mRNA的表達變化，在SAH發(fā)生后的1 d，Bcl-2 mRNA的表達開始出現(xiàn)降低趨勢，3 d明顯降低，5~7 d降低到最低水平；而Bax mRNA在SAH組表達隨SAH時間的延長呈現(xiàn)增高，1 d組只有輕微表達，3 d組開始明顯表達，5~7 d時最高，表明在SAH組腦缺血后海馬神經(jīng)元中凋亡抑制因子Bcl-2的表達受到抑制和凋亡促進因子Bax的表達增強，Bcl-2和bax的比值發(fā)生了轉(zhuǎn)變，這一表達和比值的改變可能促進了海馬神經(jīng)元的凋亡^[9]，這可能是SAH 后CVS 造成缺血性腦損傷的機制之一。

從本實驗結(jié)果還可以看出，海馬內(nèi)Bcl-2和BaxmRNA的表達變化最早出現(xiàn)在SAH發(fā)生后的1 d，提示SAH 后CVS 導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元的損傷在早期即可發(fā)生，3~7 d損傷嚴重，這一結(jié)果和臨床報導(dǎo)一致^[10-11]，有人發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉可誘導(dǎo)Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，使Bcl-2與Bax的比值增大，發(fā)揮抗細胞凋亡作用^[12]。然而，SAH后CVS的神經(jīng)損傷機制和環(huán)節(jié)非常復(fù)雜，相關(guān)措施應(yīng)用于臨床發(fā)揮治療作用尚需進一步研究和證實。但可以預(yù)見，從分子和基因水平干預(yù)SAH后CVS的損傷過程，減少神經(jīng)元凋亡，將會給臨床治療帶來希望。

參 考 文 獻

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