安勝欣　江章應(yīng)　彭成松

摘 要： 構(gòu)建S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（sam2）的基因工程菌，為S-腺苷甲硫氨酸(S-ade nosylmethionine，SAM)的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。應(yīng)用PCR技術(shù)從釀酒酵母的總DNA中擴(kuò)增出 1.2 kb的sam2，構(gòu)建重組載體pET28a-sam2，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表 達(dá)和分析。SDS-PAGE顯 示重組克隆表達(dá)的SAM2分子量約47 kD，重組蛋白量約細(xì)菌總蛋白的20.1% ，酶活達(dá)到19.6 nmol/(h?mL)，大腸桿菌表達(dá)出了具有生物活性的sam2。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母；SAM；克隆

中圖分類號：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-1098(2008)03-0065-04

SAM是生物體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)，參與體內(nèi)40多種生化反應(yīng)［1-4］，對關(guān) 節(jié) 炎、抑郁癥、肝功能紊亂等均有較好的療效，而且還是預(yù)防癌癥、心血管疾病和抗衰老的高 級保健品［5］。因此，研制、開發(fā)SAM具有重要理論和實(shí)際意義。

盡管SAM的療效已得到人們的認(rèn)可，但生產(chǎn)成本昂貴使其應(yīng)用受到限制。目前國內(nèi)外都 在競相開發(fā)廉價的SAM合成工藝。SAM的制備主要有發(fā)酵法和酶促合成法［6-8］， 后者雖具有終產(chǎn)物積累量高，易分離純化等優(yōu)點(diǎn)，但因原料ATP成本高，已很少使用。發(fā)酵 法因其生產(chǎn) 工藝簡單、成本低成為較為有效的工業(yè)化生產(chǎn)方法，但受微生物自身?xiàng)l件的限制，如SAM 合成酶含量少、酶活不高［9］，而且分離純化困難。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利 用高活力的腺苷甲硫氨酸合成酶基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM以提高其產(chǎn)量成為可能。而釀酒酵 母sam2的活力較其它微生物高成為理想的酶源［10］。就目前已經(jīng)構(gòu)建的基因工 程菌［11-13］來說，大腸桿菌具有生產(chǎn)周期短、工藝操作簡單、原料成本低等優(yōu)點(diǎn) ，是較為理想的宿主來源。本文以釀酒酵母作為出發(fā)菌株，克隆sam2，并將其轉(zhuǎn)入大腸 桿菌中進(jìn)行表達(dá)，旨在為SAM的廉價工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

釀酒酵母、E.coli DH5 a、E.coli BL21(DE3)均為實(shí)驗(yàn)室保存；pUCm-T 載體表 達(dá)載體p ET28a購自上海生物工程有限公司。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及DN A ladder、各種試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品；IPTG、氨芐青霉素、卡那霉素為Merck公司產(chǎn) 品；低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為上海生物化學(xué)研究所產(chǎn)品；丙烯酰胺，2N′-亞甲基雙丙烯酰胺 為欣經(jīng)科公司產(chǎn)品；SAM標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品；其他生化試劑或常規(guī)試劑均為分析純或者 超純。

1.2 方法

(1) 釀酒酵母基因組DNA的提取方法 按照基因組DNA提取試劑盒說明 書進(jìn)行制備。

(2) PCR擴(kuò)增sam2 參考GenBank中（登錄號M23368）sam2的 基因序列設(shè)計(jì)軟件PCR引物：

上游引物P₁： 5′－CGGAATTCATGTCCAAGAGCAAAACTTT－3′

下游引物P₂： 5′－CCAAGCTTAGCATAAAGAAAGGGATTGA－3′

其中上、下游引物中加入EcoR I、Hind III酶切位點(diǎn)。 以1.2.1提取的基 因組DNA為 模板，以P₁、 P₂為引物擴(kuò)增sam2。 PCR反應(yīng)參數(shù)為： 模板 2 μL； 10× 緩沖液 5 μL；引物1、引物2(20 μM) 2 μL；四種 脫氧 核苷酸(25 mM) 0.5 μL； MgCl₂(25 mM) 3 μL；DNA聚合酶0.5 μL；總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件： 9 4 ℃ 變性5 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃復(fù)性45 s、 72 ℃延伸1 min， 30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳。

(3) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用DNA快速純化片斷回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物中約1 .2 kb的DNA 片斷。回收片斷與載體pUCm-T連接過夜后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a，菌液涂布于含有IPTG 、X-gal及氨芐青霉素（70 μg/μL）LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后將長有菌落的平板置4 ℃冰箱數(shù)小時，用消毒的牙簽挑取 白色菌落，提取質(zhì)粒，EcoR I、Xhol I雙酶切鑒定篩選陽性重組子。將篩選 的陽性重組子pUCm-sam 2送上海生物工程公司測序分析。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pUCm-sam2切下目的片斷后，與 用此兩種酶雙酶切的表達(dá)載體pET28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-sam2，轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE₃)，涂布于含卡那霉素(30 μg/μL)的LB平板上，酶切鑒定以篩 選陽性。

(4) sam2的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 將鑒定的陽性克隆單菌落 3 7 ℃培養(yǎng)過夜后以1%接種量接種于含卡那霉素(30 μg/μL)的LB 培養(yǎng) 基中擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)至A600=0.5時，添加IPTG至終濃度為1 mmo l/L 來誘導(dǎo)表達(dá)SAM2。對誘導(dǎo)表達(dá)的不同時間取樣進(jìn)行分析。樣品離心收集菌體，用100 μL的上樣緩沖液重懸。沸水煮5 min，高速離心，取10 μL 上清按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE（分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%）電泳。

(5) sam2表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及酶活測定 將轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)大培養(yǎng)到10 0 mL LB培養(yǎng)基中， 37 ℃， IPTG 1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá) 一定時 間后離心收集菌體， 用PBS緩沖液洗2次，加溶菌酶至質(zhì)量濃度為1.5 mg/L，3 7 ℃緩慢振蕩3 h，用0.2 M的HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，鏡檢的 細(xì)胞破碎情況，離心收集細(xì)胞碎片（4 ℃，12 000 g，20 min）和上清液。將細(xì)胞碎片和上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析。

酶活力參考文獻(xiàn)［6］296進(jìn)行測定。酶的活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，37 ℃，60 min催化形成1 μmolSAM所需要的酶量為一個 活力單位。

2 結(jié)果

2.1 sam2的擴(kuò)增

將PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，可得到一條約1.2 kb的DNA片斷，與s am2基因編碼的序列大小一致（見圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化平板上的白色菌落，37 ℃振蕩培養(yǎng)后快速提取質(zhì)粒，將經(jīng)雙酶切 鑒定篩選的陽性重組子pUCm-sam2送至上海生工測序鑒定，測序結(jié)果表明有四個核苷酸 發(fā)生突變，但由于密碼子的簡并性，氨基酸并沒有發(fā)生改變。將上述sam2基因片段與pE T28a連接后，轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE₃)，涂布于含卡那霉素(30 μg/μL) 的L B平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑選菌落，抽提質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒 定，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析，分析結(jié)果表明pET28a上也插入了1.2 kb的D NA片斷見圖2。

2.3 sam2的SDS-PAGE

SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖3， IPTG誘導(dǎo)1 h， 2 h，4 h ，6 h，8 h，10 h，外源蛋白S-腺苷甲 硫氨酸合成酶均有表達(dá)，且隨著時間的延長表達(dá)量增大。對電泳結(jié)果掃描顯示，在8 h時表達(dá)量最大，可達(dá)到細(xì)菌總蛋白20.1%。外源蛋白的相對分子量約為47 kD，其中包含了利用該載體在重組蛋白N端附加的34個氨基酸的相對分子量，附加的氨基 酸含有6個組氨酸的標(biāo)記蛋白。所測得的相對分子量減去載體自帶的34個氨基酸的相對分子 量與釀酒酵母中sam2表達(dá)的蛋白的相對分子量43 kD是相符的。

2.4 sam2表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及酶活測定

將經(jīng)1.2(5)處理后的上清和細(xì)胞碎片進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析（見圖4）。由圖4可以看出 sa m2表達(dá)蛋白大多存在于細(xì)胞碎片中，以包涵體形式存在，以水溶形式存在的量很少。

圖4 SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)形式 將上述處理得到包涵體用洗滌液洗滌，然后溶解在含8 mol/L的尿素變性緩沖液 中，4 ℃放置過夜后稀釋20倍，加入還原型谷胱甘肽（2 mmol/L） 和氧化型谷胱甘肽（0.5 mmol/L）于4 ℃復(fù)性24 h。 最后用0.45 μm膜過濾后， 用鎳離子親和層析濃縮純化重組蛋白。 用純化后 的蛋 白測定酶活力。 高效液相色譜測定結(jié)果表明： 純化蛋白的酶活達(dá)到19.6 nmol /(h?mL)， 大腸桿菌表達(dá)出有活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。

3 討論

大腸桿菌是基因工程中采用最多的蛋白質(zhì)表達(dá)體系，因其遺傳背景清楚、技術(shù)操作簡便 、培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，常常作為外源基因高效表達(dá)的首選體系。但是因大腸桿 菌結(jié)構(gòu)簡單，細(xì)胞缺少真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，并且作為大腸桿菌原核表達(dá)載體不具備 識別內(nèi)含子、外顯子的能力。根據(jù)釀酒酵母的蛋白數(shù)據(jù)庫及其基因組數(shù)據(jù)庫的信息表明，釀 酒酵母的sam2不具備內(nèi)含子，所以可以直接以釀酒酵母的染色體DNA為模板，為工業(yè)化 生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

本文通過一系列的分子生物學(xué)操作，成功的構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-sam2并將其轉(zhuǎn)入大 腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE圖顯示外源蛋白分子量的大小約為47 kD，而理論值為43 kD，是除了sam2基因得以正常表達(dá)外，表達(dá)載體 自身的102個堿基也得到了表達(dá)。外源蛋白減去表達(dá)載體上的102個堿基所翻譯的34個氨基酸 的相對分子量后大約為43 kD，與理論相符。

基因表達(dá)產(chǎn)物能否在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定積累而不被內(nèi)源蛋白水解酶所水解是克隆基因的有 效表達(dá)的一個重要因素。某些外源蛋白可以在宿主細(xì)胞中以包涵體的形式表達(dá)，這種不溶性 的沉淀復(fù)合物可以抵抗宿主細(xì)胞蛋白酶的降解，也便于純化。然而經(jīng)包涵體純化的重組蛋白 必須經(jīng)過變性-復(fù)性的處理，才能獲得具有生物活性的蛋白。但在變性-復(fù)性的處理中可能對 蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象造成不可預(yù)知的影響［14］。有本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，sam2酶活力為19 .6 nmol/(h?mL)可以看出，酶活力相對較低，這可能就是在變性-復(fù)性的處理 中，其天然構(gòu)象發(fā)生變化，使 活性降低；另外，包涵體是也是蛋白高效表達(dá)的結(jié)果，低溫培養(yǎng)可以防止包涵體的生成，以 后實(shí)驗(yàn)可以在低溫條件下進(jìn)行，避免形成包涵體影響酶活力。也可以通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提 高sam2的酶活以提高蛋白的產(chǎn)量。

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(責(zé)任編輯：李 麗)