張東晨　吳學鳳　劉志勇　孫培林

摘 要： 微生物絮凝劑屬于新型天然高分子絮凝劑，它與傳統(tǒng)化工類絮凝劑相比具有絮凝效果 顯著及環(huán)保等優(yōu)點。本文把醬油曲霉作為煤炭微生物絮凝劑的產(chǎn)生菌，采用離心沉降和超聲 波破碎等方法，研究了醬油曲霉的培養(yǎng)液原液、培養(yǎng)原液離心上清液、破碎液、破碎液離心 上清液等含有不同成分的四種菌體提取液對煤泥水的絮凝效果。絮凝試驗結(jié)果表明：醬油曲 霉具有不同成分的菌體產(chǎn)生液對煤泥水都具有一定的絮凝作用。其中采用破碎液離心上清液 ，當菌液量為1.5％，在添加助凝劑（CaCl2）用量為0.2 g/L的條件下。絮凝 率最高可達到90.76％。作為煤炭生物絮凝劑醬油曲霉具有優(yōu)良的絮凝效果。

關鍵詞：煤炭；微生物絮凝劑；醬油曲霉

中圖分類號：TD925.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1098(2008)03-0042-04

微生物絮凝劑是利用生物技術，通過對具有絮凝作用的微生物進行培養(yǎng)、抽提、精制而得到 的一種具有可生物降解性和安全性的新型、高效、無毒的天然高分子絮凝劑。其獨特的 生物可降解性質(zhì)緣于微生物絮凝劑特有的機能性蛋白質(zhì)及機能性多糖類物質(zhì)，這是化工類無 機凝聚劑或合成有機高分子絮凝劑所不具備的［1-5］。本文選擇醬油曲霉作為煤 炭微生物絮凝劑的產(chǎn)生菌，并利用含有不同成分的四種醬油曲霉菌體提取液進行了煤泥水絮 凝試驗。

1 試驗研究方法

1.1 主要試劑和儀器

藥品試劑：蔗糖（生化）、瓊脂（生化）、硝酸鈉（NaNO₃）、磷酸氫二鉀（K₂HPO₄ ）、七水硫酸鎂（MgSO₄?7H₂O）、氯化鉀（KCl）、七水硫酸亞鐵（FeSO₄?7H₂O ）等。

儀器：恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風干燥箱、手提式壓力蒸汽滅菌器、磁力加熱攪拌器、超聲 波破碎儀、回旋式振蕩器、低速離心機、752型紫外分光光度計、數(shù)碼電子顯微鏡等。

1.2 菌種的來源、活化與富集培養(yǎng)

試驗菌種購自中國科學院微生物研究所(As3.495（Asp.sojae）)。

采用查氏培養(yǎng)基作為菌種活化富集培養(yǎng)基。由于菌種保藏在真空安瓿管內(nèi)，使用前需 要進行菌種的恢復培養(yǎng)，其步驟如下：

(1) 安瓿管開封 用浸過75％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管， 用火焰加熱其頂端， 滴少量無菌 水至加熱頂端使之破裂， 用銼刀或鑷子敲下已破裂的安瓿管頂端。

(2) 菌株恢復培養(yǎng) 用無菌吸管吸取0.3～0.5 mL適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安瓿管內(nèi) ，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基上（或平 板培養(yǎng)基，試驗中制備了平板、斜面和液體培養(yǎng)液三種培養(yǎng)基），于電熱恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)?；罨?8 h后培養(yǎng)基中出現(xiàn)少許黃色菌落，隨培養(yǎng)時間延長 菌落逐漸長大，最后連成線，并且某些菌落變成暗黃色。對平板菌落進行鏡檢。菌種活化后 置冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆茫?-12］。

無菌條件下用接種環(huán)自查氏平板上挑取經(jīng)活化的單個純菌落， 植入裝有查氏培養(yǎng)液 的試管中28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察發(fā)現(xiàn)： 培養(yǎng)液中有懸浮絮狀 菌絲， 即實現(xiàn)了醬油曲霉的增殖， 然后進行鏡檢(見圖1～圖3)。

1.3 制備微生物絮凝劑

在250 mL的錐形瓶中裝入50 mL查氏培養(yǎng)液，滅菌后將5 mL醬油曲霉富集培養(yǎng)液用無菌移液管接種于錐形瓶中，在28 ℃，140 r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)， 分別于接種后36 h、 48 h、 6 0 h、72 h、84 h、96 h每隔12 h取培養(yǎng)液制成生物絮凝劑，并測定其對煤泥水的絮凝率。四種微生物絮凝劑分 別為： 培養(yǎng)液原液（A）、 培養(yǎng)液離心上清液（B）、破碎液（C）、破碎液離心上清液（D ）。

取部分培養(yǎng)液超聲波破碎30 min，得到破碎液；再分別 取部分培養(yǎng)液和破碎液分別以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min ，得到兩種離心上清液(見圖4) 。這樣得到四種微生物絮凝劑：培養(yǎng)原液（A）、培養(yǎng)液離心上清液（B）、破碎液（C）、 破碎液離心上清液（D）。

1.4 醬油曲霉菌體產(chǎn)生液的絮凝試驗研究

取制備的絮凝劑（A）即菌體培養(yǎng)原液對醬油曲霉的生長量進行測定，并用pH計測定不 同培養(yǎng)時間點時培養(yǎng)液的pH。

絮凝試驗所用煤泥水取自淮南望峰崗選煤廠的浮選尾煤水，試驗時將90 mL的煤 泥水置于燒杯中，加入一定量微生物絮凝劑，加煤泥水至100 mL，用磁 力攪拌器慢速攪拌2 min后，將煤泥水倒入100 mL量筒中，觀察煤泥水絮 凝沉降情況，靜置30 min后吸取一定量上清液，用分光光度計在550 nm下測其吸光度［13-14］。

微生物絮凝劑的絮凝效果以絮凝率來衡量，其計算公式為

絮凝率=(Ao-Ai)/Ao×100%

式中：Ao為對照組上清液的OD550值；Ai為加入微生物絮凝劑絮凝之 后上清液的OD550值，OD值的測定在752型紫外分光光度計550 nm處測定。

煤泥水絮凝試驗中，四種菌液的用量分別為：0.5%、1%、1.5%、2%。添加助凝劑（CaCl₂）用量為：0.2 g/L。其作用是降低煤粒表面電荷對生物絮凝劑。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 醬油曲霉生長量及細菌培養(yǎng)原液pH分析

取絮凝劑（A）即細菌培養(yǎng)原液，根據(jù)微生物生長量的測定方法，對醬油曲霉在不同生長時 期進行生長量的測定，得到醬油曲霉的生長曲線（見圖5）。用pH計測定不同培養(yǎng)時間點時 細菌培養(yǎng)原液的pH。得到細菌培養(yǎng)原液pH隨培養(yǎng)時間的變化曲線（見圖6）。

培養(yǎng)過程中24 h之前醬油曲霉的菌量幾乎沒有增加，24～36 h醬油 曲霉生長非常緩慢，生長量很小，36 h之后菌體開始迅速生長，此時生長速度 最快，60～84 h菌體生長速度較之前12 h慢，84 h之后菌體又一次開始快速生長，由此可知，醬油曲霉的生長期應處于36～96 h。

隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液的pH呈現(xiàn)出不穩(wěn)定的變化，但總體趨勢是隨著培養(yǎng)時間 的延長pH逐漸降低。在醬油曲霉的生長過程中培養(yǎng)液的pH逐漸降低，其原因可能是由于 在醬油曲霉生長過程中會代謝出一種酸性物質(zhì)，而且隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體量增加導致 培養(yǎng)液的pH繼續(xù)降低。

2.2 絮凝試驗結(jié)果分析

微生物培養(yǎng)48 h時的絮凝率較高，而隨著培養(yǎng)時間延長，在60 h、 72 h時絮凝率都有降低，培養(yǎng)84 h時絮凝率又有增高，然后絮凝率 又隨培養(yǎng)時間延長而降低(見圖7a～圖7b)。而圖7c～圖7d中第一個絮凝率最高點也是48 h，但是第二個最高點卻是在72 h時，微生物絮凝劑（D），即破碎液離心上清液，在菌體培養(yǎng)48 h，加藥量 為1.5％時的絮凝率達到89.56％。培養(yǎng)72 h時，添加菌液量為1.5％，絮凝率最 高可達到90.76％。

培養(yǎng)48 h時，菌體代謝產(chǎn)生的絮凝物質(zhì)還是很少量的，此時主要起絮凝作用的 是菌體本 身，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體代謝產(chǎn)生的具有絮凝作用的物質(zhì)越來越多，慢慢起絮凝作用 的主要物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫w的代謝產(chǎn)物和菌體內(nèi)物質(zhì)。但是，這些不同類型的微生物絮凝劑相互 之間對絮凝作用會形成干擾，降低絮凝效果。所以表現(xiàn)為：隨著培養(yǎng)時間的延長， 菌體代謝 產(chǎn)物越來越多，而絮凝劑的絮凝率卻在逐漸降低，達到最低點。說明菌體代謝產(chǎn)物和菌體內(nèi) 物質(zhì)可在一定程度上抑制菌體本身的絮凝作用。此后，代謝產(chǎn)物的絮凝作用超過了菌體本身 ，起主要絮凝作用，絮凝率又逐漸增加。根據(jù)菌體生長的規(guī)律，菌體都有一個存活期，達到 一定時間菌體就會死亡，從而生命活動終止，不能產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，所以培養(yǎng)時間繼續(xù)延長， 絮凝劑的絮凝效果再一次降低。

破碎液的絮凝率比培養(yǎng)原液高。這是因為超聲波破碎后，破壞了菌體的表面結(jié)構(gòu)，使得 菌體內(nèi)部物質(zhì)裸露出來，以上的絮凝效果說明微生物絮凝劑不僅僅存在于菌體的表面，也存 在于菌體的代謝產(chǎn)物及菌體體內(nèi)。

圖7 不同培養(yǎng)時間條件下四種菌液對煤泥水的絮凝效果 對比試驗表明，由于醬油曲霉破碎液中含有的菌體及菌體破碎體等物質(zhì)對絮凝有一定的 干擾作用，而破碎離心上清液去除了對絮凝干擾的物質(zhì)。因此，破碎離心上清液（D）的絮 凝效果要優(yōu)于單純破碎液（C）的絮凝效果（見圖8）。醬油曲霉的破碎液離心上清液 ，當菌 體培養(yǎng)72 h，添加菌液量為1.5％，助凝劑（CaCl₂）用量為0.2 g/L時，煤泥水絮凝率達到了90.76％。

3 結(jié)論

(1) 生物絮凝劑屬于天然高分子絮凝劑，它與化工類無機凝聚劑和有機高分子絮凝劑相比更 加綠色環(huán)保。在煤炭加工領域，對生物絮凝劑的研究具有重要的現(xiàn)實意義。

(2) 本文選擇醬油曲霉作為煤炭微生物絮凝劑的產(chǎn)生菌，采用離心沉降和超聲波破碎等抽 提制取方法，研究了含有不同絮凝活性成分的四種菌體提取液對煤泥水的絮凝效果。絮凝試 驗結(jié)果表明：醬油曲霉作為生物絮凝劑產(chǎn)生菌，其具有不同成分的菌體產(chǎn)生液對煤泥水都具 有 一定的絮凝作用。研究表明，醬油曲霉作為煤炭生物絮凝劑產(chǎn)生菌具有性能優(yōu)良的絮凝效果 ，應對其進行更深入研究。

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(責任編輯：李 麗)