趙德立　曾林子　李　暉　陳金瑞　劉成君

摘要多粘芽孢桿菌Jw—725對柑橘青霉具有很強的拮抗作用。通過5因素4水平正交試驗明確，應(yīng)用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始pH 9．o，30℃．通氣量loomL接種量為10％．140 r／min振蕩培養(yǎng)?2h時的發(fā)酵液具有最佳抗苗活性。該菌胞外抗菌物質(zhì)可用乙酸乙酯單一溶劑提取。

關(guān)鍵詞生物工程；多粘芽孢桿菌；抗真菌活性物質(zhì)；發(fā)酵條件

中圖分類號S 482．212

芽孢桿菌具有抗菌防病作用和很強的抗逆能力，其中許多性狀優(yōu)良的拮抗菌株已成功地應(yīng)用于植物病害防治。芽孢桿菌抗菌防病機制包括競爭作用、拮抗作用和誘導(dǎo)植物抗病性，其中拮抗作用是其最主要的抗菌機制。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要有幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等蛋白、抗菌肽以及一些次生代謝產(chǎn)物。

柑橘青霉菌是柑橘貯藏期和運輸期中的重要病原真菌，通常用甲基托布津、多菌靈等化學(xué)藥劑防治。研究柑橘病原真菌的拮抗菌，為解決病原菌對化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性和果品農(nóng)藥殘留問題，尋找新的途徑。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1拮抗菌

多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymy,ra jW—725)由本實驗室從西藏類烏齊協(xié)馬高山口草甸(海拔4671m)土樣篩選得到。

1．1，2病原指示菌

柑橘青霉菌(Penicillicum italicum)為本實驗室分離保存。

1．1．3培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基：酵母膏5．0 g，蛋白胨10．Og，NaCl 10．0g蒸餾水1000 mL，pH 6．0—9．0．121℃滅菌20min。

(2)PDA培養(yǎng)基：20％馬鈴薯汁100ML葡萄糖2.0g，瓊脂2.0g，pH 6．0～7．O，115℃滅菌30min。

(3)NA，BPY，YPG培養(yǎng)基.

1．2方法

1．2．1同步培養(yǎng)抑菌試驗

在PDA平板上接指示菌柑橘青霉菌孢子和多粘芽孢桿菌JW 725各1環(huán)。兩點相距5 cm，27亡恒溫培養(yǎng)粕正放培養(yǎng)3d，觀察結(jié)果。

1．2．2多粘芽孢桿菌液體培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：接種B．pol3wO,．roJW 725單菌落到20 n、I。液體LB(100ML三角瓶)，30℃，140 r／min，振蕩培養(yǎng)48h發(fā)酵培養(yǎng)：10％接種量，接種子培養(yǎng)液到100血。液體I衛(wèi)培養(yǎng)基中(500mI三角瓶)。30℃，140r／min，振蕩培養(yǎng)72h。

1．2．3抑菌活性的檢測

抑菌圈測量采用牛津環(huán)法和打孔法。

1．2．4蛋白濃度的測定應(yīng)用考馬斯亮藍法。

1．2．5抑菌作用觀察

肉眼觀察p．italicum的菌落正常菌絲和受拮抗菌抑制后的形態(tài)、顏色變化；分別挑取正常戶．italicum幼齡菌絲、產(chǎn)孢菌絲及受拮抗菌抑制的菌絲制片，石炭酸美蘭染色，100倍油鏡觀察具微觀形態(tài)變化。

1．2．6正交法確定多粘芽孢桿菌最佳發(fā)酵條件…

考察5個因素：培養(yǎng)基種類、初始pH、培養(yǎng)時間、通氣量及接種量對多粘芽孢桿菌JW 725產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的影響，并通過比較得到5因素的最佳配比。

按正交表5因素4水平安排試驗，取不同培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液，分別測菌液吸光值(()Doso)，無菌發(fā)酵液的粗蛋白吸光值(OD)和發(fā)酵液的抑菌活性(抑菌圈直徑)。

1．2．7拮抗菌生長曲線與抑菌時程曲線

于不同時刻，分別取多粘芽孢桿菌JW－725LB發(fā)酵培養(yǎng)液，測定菌懸液吸光值(OD₅₈₀)和測量抑菌圈直徑大小。

1．2．8發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的定位

(1)胞內(nèi)發(fā)酵液離心得菌體，經(jīng)超聲波破壁和石英砂研磨破壁，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為破壁緩沖液，離心并作無菌過濾，得無菌破碎液，做抑菌試驗，測量抑菌圈。

(2)胞外用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮無菌濾液，濃縮100倍，做抑菌試驗，測量抑菌圈。

(3)孢子平板上放置一張無菌濾膜，上面點多粘芽孢桿菌jW—725單菌落，正放，培養(yǎng)2～3 d，揭濾膜，觀察抑菌情況。

1．2．9抗菌活性物質(zhì)的提取

(1)飽和硫酸銨沉淀

發(fā)酵液用飽和度日80％硫酸銨沉淀，PBS緩沖液稀釋，經(jīng)o．22um徑無菌濾膜過濾得無菌蛋白濾液，4℃冰箱保存。用粗蛋白液做抑菌實驗，無菌LB液體培養(yǎng)基做對照。

(2)乙酸乙酯抽提和濃縮

發(fā)酵液離心上清，加等體積乙酸乙酯于分液漏斗中振蕩混勻過夜，收集乙酸乙酯層并轉(zhuǎn)入球形漏斗，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用少量無菌水洗出。用該濃縮液做抑菌實驗，無菌水做對照。

2結(jié)果

2．1同步培養(yǎng)抑菌試驗

多粘芽孢桿菌JW～725在PDA平板上對柑橘青霉有較強抑菌力，如圖1。同步對峙培養(yǎng)3 d后，病原菌柑橘青霉長勢較快，漫布大部分平皿；拮抗菌多粘芽孢桿菌的菌落直徑約1 Chl，其與病原真菌接觸方向，有明顯透明弧形抑菌帶，帶寬1．o一1．5cm。

2．2多粘芽孢桿菌發(fā)酵液對柑橘青霉菌的影響

在PDA含柑橘青霉菌孢子平板上打孔，加多粘芽抱桿菌發(fā)酵液，培養(yǎng)3d后，平板上出現(xiàn)抑菌圈“雙圈”現(xiàn)象，內(nèi)圈有柑橘青霉菌增生堆積；外圈柑橘青霉菌菌絲由幼齡白色變?yōu)槌墒斓那嗑G色，并從抑苗圃邊沿開始，由內(nèi)向外變?yōu)榭蔹S色，而正常菌絲則保持青綠色至長滿孢子。

顯微鏡下油鏡觀察，抑菌圈周圍被抑制的柑橘青霉菌菌絲有大量異常分支，分支菌絲較短，但未見菌絲有明顯破裂現(xiàn)象。

2．3最佳發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果及分析

分別對多粘芽孢桿鹵JW-725菌株濃度，蛋白質(zhì)含量，發(fā)酵液抑菌圈直徑的正交試驗結(jié)果按文獻L11)進行直觀分析。由表2可知，發(fā)酵條件5因素對多粘芽孢桿菌JW—725菌體濃度的影響，大小順序為：通氣量>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)基>接種量>培養(yǎng)基初始pH。對發(fā)酵液蛋白含量的影響，大小順序為：培養(yǎng)基>接種量>培養(yǎng)基初始pH>培養(yǎng)時間>通氣量。

發(fā)酵條件5種因素對多粘芽孢桿菌JW—725發(fā)酵液活性的影響大小順序為：培養(yǎng)基>接種量>培養(yǎng)基初始pH>培養(yǎng)時間>通氣量。

試驗也發(fā)現(xiàn)5種因素4水平的多粘芽孢桿菌JW 725最佳抑菌活性的發(fā)酵條件為：LB培養(yǎng)基，初始pH9，通氣量100 mi接種量Io％，發(fā)酵時間72h。

2．4多粘芽孢菌桿生長曲線和抑菌時程曲線

如圖2所示，多粘芽孢菌桿JW—725在培養(yǎng)18h時達到菌體最大濃度，從菌體開始生長到穩(wěn)定期，發(fā)酵液中都有抑菌活性，12h有最大抑菌活性。圖2多粘芽孢桿菌Jw—725發(fā)酵液OD值與抑菌活性曲線

2．5抗菌活性物質(zhì)的定位

經(jīng)過多種方法破碎多粘芽孢桿菌JW-725細胞，無菌細胞破碎液均沒發(fā)現(xiàn)有明顯抑菌圈。發(fā)酵上清液，經(jīng)o．22um孔徑濾膜過濾，也未發(fā)現(xiàn)有明顯抑菌圈。將無菌濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮100倍后，有明顯抑菌圈出現(xiàn)。

直接在無菌濾膜上點拮抗菌平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，膜上拮抗菌菌落直徑5 mm，膜下產(chǎn)生直徑13 mm抑菌圈。表明多粘芽孢桿菌JW-725產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，泫活性物質(zhì)能夠透過o．22um孔徑濾膜。

2．6抗菌活性物的提取

1)發(fā)酸液經(jīng)過80％硫酸銨沉淀，蛋白粗提液未經(jīng)過濾膜過濾的有明顯抑菌活性；但經(jīng)濾膜過濾后未表現(xiàn)有明顯抑菌活性。

2)發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯抽提濃縮，無菌水稀釋做抑菌實驗，有明顯抑菌活性。

在I．B固體平板上涂布少量乙酸乙酯抽提濃縮液，未發(fā)現(xiàn)有多粘芽孢桿菌長出，排除可能殘留菌體的影響，表明乙酸乙酯可把發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)初步抽提山來。

3討論

不同測量方法時發(fā)酵液抑菌活性測定有不問結(jié)果。相同發(fā)酵液樣品，用打孔法的抑菌圈比牛津環(huán)法的抑菌效果明顯，抑菌圈大，且有雙圈現(xiàn)象。柑橘青霉菌菌絲受多粘芽孢桿菌和拮抗物質(zhì)共同影響．顏色發(fā)生異常變化。這種異常變化能在正常菌絲產(chǎn)生擴散，引起擴散的原因是否是因為拮抗物質(zhì)在菌絲中的擴散還是柑橘青霉菌的某種信號傳導(dǎo)，有待確定；汕鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，柑橘青霉菌堆積的菌絲有大量異常分支，但未發(fā)現(xiàn)有菌絲破裂現(xiàn)象。

多粘芽孢桿菌體生長及其活性物質(zhì)的積累：多粘芽孢桿菌培養(yǎng)18h后進入菌體生長穩(wěn)定期，在菌體發(fā)酵后期，發(fā)酵液中抑菌活性略有增強。

拮抗物質(zhì)與菌體的協(xié)同作用對抑菌活性的影響：發(fā)酵原液有明顯抑菌效果，發(fā)酵上清液(有殘留多粘芽孢桿菌)培養(yǎng)2d后，孔內(nèi)或圈內(nèi)明顯有菌體生長，也有較強抑菌活性，其無菌濾液培養(yǎng)2d后無明顯抑菌效果，而濾液濃縮后有抑菌效果。發(fā)酵液離心上清經(jīng)過乙酸乙酯抽提，可抽提到拮抗物質(zhì)。這表明，多粘芽孢桿JW-725菌株產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的產(chǎn)量偏低，發(fā)酵液的抑菌活性是受到菌體本身和活性物質(zhì)的雙重影響，并且多粘芽孢桿菌菌體本身對柑橘青霉菌的影響可能比較大。