摘要：探討了不同保護(hù)液配方對(duì)重組蛋白穩(wěn)定性的影響，并將其應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳保護(hù)液配方，包括甘油、蔗糖、BSA和吐溫20等成分。結(jié)果表明，優(yōu)化后的保護(hù)液能顯著提高重組熒光素酶的熱穩(wěn)定性和長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。將該保護(hù)液應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)人血清中甲胎蛋白（AFP），檢測(cè)靈敏度提高了2倍，線性范圍擴(kuò)大到0.1～1 000.0 ng/mL。為提高重組蛋白穩(wěn)定性和改善化學(xué)發(fā)光檢測(cè)性能提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：重組蛋白；保護(hù)液；穩(wěn)定性；化學(xué)發(fā)光；免疫分析

重組蛋白在生物醫(yī)藥、診斷試劑等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，但其穩(wěn)定性一直是制約應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。提高重組蛋白的穩(wěn)定性對(duì)于延長(zhǎng)其保質(zhì)期、保持活性至關(guān)重要。保護(hù)液作為一種常用的穩(wěn)定劑，其配方設(shè)計(jì)直接影響蛋白的穩(wěn)定性。本研究以重組熒光素酶為模型蛋白，系統(tǒng)研究了保護(hù)液成分對(duì)其穩(wěn)定性的影響，并將優(yōu)化后的保護(hù)液應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析，以期為相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究所用的主要材料和試劑包括：重組熒光素酶（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得）、甘油、蔗糖、牛血清白蛋白、吐溫20、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、D熒光素（化學(xué)發(fā)光底物）、人甲胎蛋白（AFP）標(biāo)準(zhǔn)品、抗AFP單克隆抗體和多克隆抗體、羧基修飾磁性納米顆粒（直徑1 μm）、1乙基3（3二甲基氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰亞胺。磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）和三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（pH 8.0，由實(shí)驗(yàn)室自制）。所有化學(xué)試劑均為分析純或更高純度，實(shí)驗(yàn)用水為超純水系統(tǒng)制備的去離子水。

1.2儀器與設(shè)備

研究使用的主要儀器設(shè)備包括：高速離心機(jī)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、蛋白電泳系統(tǒng)、蛋白純化系統(tǒng)、多功能酶標(biāo)儀、恒溫混勻儀、pH計(jì)、電子天平、微量離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、振蕩器、冷凍離心機(jī)、超速離心機(jī)、倒置熒光顯微鏡和納米粒度分析儀。這些儀器設(shè)備覆蓋了蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、分析和應(yīng)用的全過(guò)程，確保了實(shí)驗(yàn)操作的精確性和數(shù)據(jù)的可靠性。所有儀器在使用前均按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)量控制，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

1.3重組熒光素酶的表達(dá)與純化

重組熒光素酶的表達(dá)采用大腸桿菌BL21（DE3）株系，將含有目的基因的pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入菌株中［1］，挑選單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日將培養(yǎng)物按1∶100比例接種至1 L LB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至OD 600達(dá)0.6～0.8。加入IPTG至終濃度0.5 mmol誘導(dǎo)表達(dá)，18 ℃培養(yǎng)16 h。離心收集菌體，超聲破碎后12 000 g離心20 min分離上清液。上清液經(jīng)過(guò)NiNTA親和層析柱純化，用含20 mmol咪唑的洗脫緩沖液洗滌，隨后用含250 mmol咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。收集的蛋白溶液用10 kDa截留分子量的超濾管濃縮并更換緩沖液為PBS（pH 7.4）。純化后的蛋白經(jīng)SDSPAGE和Western blot鑒定，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。最后，將純化的重組熒光素酶分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4保護(hù)液配方優(yōu)化

采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化保護(hù)液配方。選取4個(gè)主要因素：甘油、蔗糖、BSA和吐溫20，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平。設(shè)計(jì)L9（3^4）正交表，共進(jìn)行9組實(shí)驗(yàn)。以PBS（pH 7.4）為基礎(chǔ)緩沖液，按照正交表配制不同組合的保護(hù)液。將純化的重組熒光素酶稀釋至0.1 mg/mL，與等體積的各組保護(hù)液混合。將混合液分裝后在37 ℃、4 ℃和-20 ℃條件下儲(chǔ)存，分別在0、1、7、14、30天測(cè)定酶活性。酶活性測(cè)定采用化學(xué)發(fā)光法，使用D熒光素作為底物，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)量發(fā)光值。以酶活性保留率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)方差分析確定各因素對(duì)酶活性的影響程度。根據(jù)分析結(jié)果，選擇最優(yōu)配方進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并與商業(yè)保護(hù)液進(jìn)行對(duì)比。最終確定的最佳保護(hù)液配方為：15%（v/v）甘油、10%（w/v）蔗糖、0.1%（w/v）BSA和0.05%（v/v）吐溫20。

1.5重組熒光素酶穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

重組熒光素酶的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，主要從熱穩(wěn)定性和長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性2個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估。熱穩(wěn)定性測(cè)試中，將酶液（0.1 mg/mL）分別在25 ℃、37 ℃和45 ℃恒溫水浴中孵育，每隔30 min取樣測(cè)定剩余酶活性，直至4 h。長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)試中，將酶液在4 ℃和-20 ℃條件下儲(chǔ)存，分別在0、7、14、30、60、90天取樣測(cè)定剩余酶活性。酶活性測(cè)定采用化學(xué)發(fā)光法，使用100 μmol D熒光素作為底物，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)量30 s內(nèi)的累積發(fā)光值［2］，以初始酶活性為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的酶活性保留率。通過(guò)繪制酶活性保留率隨時(shí)間變化的曲線，評(píng)估重組熒光素酶在不同條件下的穩(wěn)定性。

1.6化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

采用雙抗體夾心法建立化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。將抗AFP單克隆抗體偶聯(lián)到羧基修飾磁性納米顆粒上，取50 μL磁珠懸液，用MES緩沖液（pH 6.0）洗滌3次，加入10 μg抗體、50 μL EDC（10 mg/mL）和50 μL NHS（10 mg/mL），室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)后用PBS洗滌3次，用1% BSA封閉1 h。將偶聯(lián)好的磁珠與100 μL樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）混合，37 ℃孵育1 h。洗滌后加入100 μL生物素化抗AFP多克隆抗體（1 μg/mL），37 ℃孵育30 min。再次洗滌后加入100 μL重組熒光素酶親和素復(fù)合物（1∶2 000稀釋），室溫孵育15 min。最后洗滌，加入100 μL D熒光素（10 μmol），立即在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)量化學(xué)發(fā)光值。

2結(jié)果與討論

2.1保護(hù)液配方對(duì)重組熒光素酶熱穩(wěn)定性的影響

本研究考察了不同保護(hù)液配方對(duì)重組熒光素酶熱穩(wěn)定性的影響。在37 ℃條件下，添加15%甘油和10%蔗糖的保護(hù)液顯著提高了酶的熱穩(wěn)定性，4 h后仍保留80%以上的活性，而無(wú)保護(hù)液的對(duì)照組僅保留30%活性［3］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，0.1%牛血清白蛋白的加入可進(jìn)一步提高熱穩(wěn)定性，使4 h后的活性保留率達(dá)到90%。這可能是由于甘油和蔗糖形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，而牛血清白蛋白則通過(guò)表面吸附減少了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，從而抑制了熱變性的發(fā)生。

2.2保護(hù)液配方對(duì)重組熒光素酶長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的保護(hù)液配方顯著延長(zhǎng)了重組熒光素酶的儲(chǔ)存期限。在4 ℃條件下，添加保護(hù)液的酶液在90天后仍保持85%的初始活性，而無(wú)保護(hù)液的對(duì)照組活性降至40%。-20 ℃儲(chǔ)存條件下，保護(hù)液的效果更為顯著，90天后酶活性保留率高達(dá)95%。分析發(fā)現(xiàn)，0.05%吐溫-20的加入對(duì)長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性有顯著貢獻(xiàn)，這可能是由于其減少酶分子在反復(fù)凍融過(guò)程中的聚集。此外，蔗糖可能通過(guò)形成玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步保護(hù)酶分子免受凍融損傷［4］。

2.3最佳保護(hù)液配方的確定

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素優(yōu)化，最終確定了重組熒光素酶的最佳保護(hù)液配方：15%甘油、10%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫20，以磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）為基礎(chǔ)。該配方在熱穩(wěn)定性和長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的效果。進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該保護(hù)液配方能夠使重組熒光素酶在37 ℃條件下4 h后保留90%以上的活性，在4 ℃儲(chǔ)存90天后保留85%以上的活性。與商業(yè)保護(hù)液相比，本研究?jī)?yōu)化的配方在各項(xiàng)指標(biāo)上均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，為重組熒光素酶的穩(wěn)定性保護(hù)提供了有效方案。

2.4優(yōu)化保護(hù)液在化學(xué)發(fā)光免疫分析中的應(yīng)用

將優(yōu)化后的保護(hù)液應(yīng)用于人甲胎蛋白（AFP）化學(xué)發(fā)光免疫分析中，顯著提高了檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性。與未添加保護(hù)液的對(duì)照組相比，檢測(cè)靈敏度提高了2倍，最低檢測(cè)限達(dá)到0.1 ng/mL［5］。線性范圍擴(kuò)大到0.1～1 000.0 ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）小于5%，批間變異系數(shù)小于8%。加入保護(hù)液后，檢測(cè)試劑在4 ℃條件下可穩(wěn)定保存3個(gè)月，室溫下工作8 h活性無(wú)明顯下降。這些結(jié)果表明，優(yōu)化的保護(hù)液配方顯著改善了化學(xué)發(fā)光免疫分析的性能，為臨床診斷提供了更可靠的方法。

3結(jié)語(yǔ)

通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化保護(hù)液配方，成功提高重組熒光素酶的穩(wěn)定性，并將其應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析中。研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的保護(hù)液配方（15%甘油、10%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫-20）顯著提高重組熒光素酶的熱穩(wěn)定性和長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在37 ℃條件下4 h后仍保留90%以上的活性，在4 ℃儲(chǔ)存90天后保留85%以上的活性。將優(yōu)化后的保護(hù)液應(yīng)用于人甲胎蛋白（AFP）化學(xué)發(fā)光免疫分析中，檢測(cè)靈敏度提高了2倍，最低檢測(cè)限達(dá)到0.1 ng/mL，線性范圍擴(kuò)大到0.1～1 000.0 ng/mL。為提高重組蛋白穩(wěn)定性和改善化學(xué)發(fā)光免疫分析性能提供了新的思路和方法，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

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作者簡(jiǎn)介：沈超，女，黑龍江哈爾濱人，研發(fā)工程師，碩士，研究方向：基因克隆重組蛋白的表達(dá)純化、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及免疫診斷試劑。