摘要：采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，分別對煙草（Nicotiana tabacum L.）品種遵煙6號和K326的多酚氧化酶（PPO）家族基因成員LOC107810501進(jìn)行靶向敲除。結(jié)果表明，LOC107810501基因被敲除后，在煙草的陽性編輯單株中未檢測到該基因的表達(dá)，同時(shí)LOC107821546、LOC107786520、LOC107773093、LOC107787563、LOC107805360基因的相對表達(dá)量均明顯下降。研究獲得了低PPO活性的煙草T0突變單株，T1世代測序檢測證明突變性狀可以穩(wěn)定遺傳。

關(guān)鍵詞：煙草（Nicotiana tabacum L.）品種；多酚氧化酶；基因編輯；遵煙6號；K326

中圖分類號：TS272；Q134；S763.3" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）01-0181-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.01.029 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on polyphenol oxidase gene editing of tobacco varieties Zunyan 6 and K326

WANG Jun1， SUN Xiao-qiong2， PAN Deng-hua1，YANG An-hua1，XU De-ze2，YIN De-suo2

（1.Zunyi Branch Company，Guizhou Tobacco Company， Zunyi" 563000， Guizhou， China；2.Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan" 430064， Hubei， China）

Abstract： Using CRISPR/Cas9 gene editing technology， the polyphenol oxidase （PPO） family gene member LOC107810501 of tobacco（Nicotiana tabacum L.） varieties Zunyan 6 and K326 was targeted and knocked out. The results showed that after knocking out the LOC107810501 gene， no expression of this gene was detected in the positive edited plants of tobacco. At the same time， the relative expression levels of LOC107821546， LOC107786520，LOC107773093， LOC107787563， and LOC107805360 genes were significantly reduced. The study obtained T0 mutant plants of tobacco with low PPO activity， and T1 generation sequencing confirmed that the mutant trait could be stably inherited.

Key words： tobacco（Nicotiana tabacum L.）；variety； polyphenol oxidase； gene editing； Zunyan 6； K326

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是影響煙葉品質(zhì)的重要因素［1］。PPO是一種含銅離子的氧化酶，在植物組織發(fā)育過程中產(chǎn)生并貯存在葉綠體中。在煙葉烘烤過程中，當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，酚類物質(zhì)被釋放出來，并與葉綠體中的PPO結(jié)合，被氧化為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)活性較強(qiáng)，繼續(xù)與其他醌類、氨基酸以及蛋白質(zhì)結(jié)合形成色素，使煙葉褐化，顏色變深，影響外觀品質(zhì)，導(dǎo)致煙葉等級下降，降低煙葉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］。同時(shí)由于煙葉失去了作為香氣成分前體物質(zhì)的多酚類化合物，導(dǎo)致煙葉吸食品質(zhì)降低［3］。因此，煙葉中過強(qiáng)的PPO活性不利于優(yōu)質(zhì)煙葉的形成，選育PPO活性弱的品種是煙草品質(zhì)改良育種的重要途徑。普通煙草（Nicotiana tabacum L.）是四倍體作物，煙草PPO基因以家族基因形式存在于煙草基因組中，家族基因間可能存在表達(dá)互補(bǔ)，并且這些PPO基因家族還存在翻譯和表達(dá)的可變剪切現(xiàn)象［4］。煙草PPO基因作用機(jī)理較復(fù)雜，增加了利用遺傳方法培養(yǎng)低PPO活性煙草品種的難度?；蚓庉嫾夹g(shù)可以實(shí)現(xiàn)對DNA序列的靶向編輯，達(dá)到對目標(biāo)序列的堿基替換和片段插入［5］?；蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn)為創(chuàng)造煙草PPO基因突變、選育低活性PPO煙草品種提供了可能。姚恒等［6］利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除煙草PPO基因NtPPO1，獲得了目標(biāo)基因表達(dá)顯著下降的突變體。Zhang等［7］采用引導(dǎo)編輯（Prime editing）工具修復(fù)了栽培煙草基因組中失活的冷杉醇合成酶基因NtCPS2，獲得了能合成冷杉醇的煙草品種。

針對煙草品種遵煙6號和K326上部煙葉耐烤性不佳，容易出現(xiàn)煙葉褐化的問題，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析，對不同煙草品種的PPO家族基因表達(dá)量進(jìn)行分析，目的是篩選鑒定主效的PPO基因，并進(jìn)行基因敲除驗(yàn)證，為創(chuàng)造低PPO活性的煙草突變體、選育耐烤性優(yōu)良的煙草品種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型煙草品種為遵煙6號、K326，取中上部煙葉作為檢測材料；DH5α大腸桿菌與EHA105感受態(tài)細(xì)胞由上海唯地生物技術(shù)有限公司提供；pCRISPR/Cas9由馬里蘭大學(xué)戚益平博士實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；引物合成與測序由武漢天一華煜基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 煙草PPO家族基因的序列分析 用關(guān)鍵詞Nicotiana tabacum polyphenol oxidase在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索煙草PPO基因組序列和mRNA（cDNA）序列。利用PCR儀擴(kuò)增基因組序列，進(jìn)行克隆和測序，確認(rèn)遵煙6號和K326中對應(yīng)的PPO基因序列和表達(dá)序列。根據(jù)表達(dá)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增引物，利用高保真PCR酶進(jìn)行擴(kuò)增，得到PPO基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2.2 葉片總RNA提取和熒光定量PCR分析

1）RNA提取。采用Trizol［8］法提取總RNA，采用NanoDrop 2000型分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）測定濃度及OD260 nm/OD280 nm，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

2）逆轉(zhuǎn)錄。利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMIX for qPCR試劑盒將待測RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 0.5 μg；5×TransScript All-in-one SuperMix for qPCR 2 μL，gDNA Remover 0.5 μL，Nuclease-free H2O補(bǔ)充至10 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。逆轉(zhuǎn)錄完畢后加入90 μL Nuclease-free H2O，儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱備用。

3）熒光定量PCR。利用PerfectStartTM Green qPCR SuperMix試劑盒在LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀（Roche，Swiss）上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×PerfectStartTM Green qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol/L Forward primer 0.2 μL，10 μmol/L Reverse prime 0.2 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-free H2O 3.6 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 s。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每攝氏度采集5次熒光信號。每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。采用 2-??Ct 法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.3 載體設(shè)計(jì) 采用雙靶點(diǎn)策略，在目標(biāo)基因的第一外顯子（Exon）區(qū)域設(shè)計(jì)第一個(gè)靶點(diǎn)（編碼鏈NGG上游），在第二外顯子的編碼區(qū)域設(shè)計(jì)第二個(gè)靶點(diǎn)（反義鏈NGG位點(diǎn)上游）。合成2個(gè)靶點(diǎn)引物后，連接至Entry clone，通過GateWay方法組裝Destination clone，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR篩選陽性克隆并測序驗(yàn)證。

1.2.4 遺傳轉(zhuǎn)化和陽性植株檢測 采用葉盤法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。通過培養(yǎng)煙草無菌苗、外植體葉盤的預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選培養(yǎng)、抗性組織再生等過程獲得轉(zhuǎn)化再生的植株。T0世代陽性單株自交收種后，T1世代單株種成株行并進(jìn)行單株T-DNA序列檢測和靶位點(diǎn)測序。

陽性再生芽在抗性篩選培養(yǎng)基上生長，NPTII標(biāo)記基因的特異引物為NPTII-F68：5′-ACTGGG CACAACAGACAATCG-3′，NPTII-R356：5′-GCATC AGCCATGATGGATACTTT-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草PPO基因家族組成

查詢GeneBank的Nicotiana tabacum polyphenol oxidase數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)煙草共有15個(gè)PPO家族基因，這些基因分布在基因組的不同位置（表1），并且序列差異較大（圖1），同時(shí)發(fā)現(xiàn)有些PPO基因還存在轉(zhuǎn)錄和翻譯的可變剪切，例如基因LOC107789348、LOC107805360和LOC107811292（圖2），這說明栽培煙草PPO基因的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)較復(fù)雜。

2.2 煙草PPO基因的表達(dá)差異

根據(jù)15個(gè)煙草PPO家族基因的RNA序列設(shè)計(jì)熒光PCR檢測引物，其中8個(gè)PPO基因能在K326和遵煙6號中檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物（表2）；將煙草Actin基因作為內(nèi)參，分別檢測野生型遵煙6號和K326的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)不同PPO基因表達(dá)量存在較大差異（表3）。

2.3 靶向基因選擇和靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

通過比較不同煙草品種PPO基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)相同PPO基因在不同品種間存在顯著表達(dá)差異。遵煙6號PPO基因家族中LOC107811292、LOC107821546、LOC107787563、LOC107810501基因表達(dá)量較高，是PPO活性的主要決定基因。而在K326 PPO基因家族中，除LOC107786520、LOC107773093基因相對表達(dá)量高于遵煙6號外，其他基因均低于遵煙6號。以中間表達(dá)水平的LOC107810501基因作為遵煙6號PPO基因敲除的候選基因，采用雙靶點(diǎn)策略，篩選靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶序列（表4）。

2.4 煙草T-DNA的檢測和靶點(diǎn)測序分析

利用T-DNA攜帶的抗性基因NPTII特異引物對T1世代的煙草植株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測（圖3），選擇無T-DNA的單株進(jìn)行靶點(diǎn)測序（圖4）。以遵煙6號為例，靶點(diǎn)測序（圖5）顯示，陽性編輯遵煙6號的2個(gè)靶位點(diǎn)之間發(fā)生了多個(gè)堿基的刪除、替換和插入，對靶點(diǎn)序列發(fā)生編輯的單株進(jìn)行PPO基因檢測。

2.5 煙草T1單株的PPO基因表達(dá)檢測

提取煙草陽性編輯單株總RNA，對8個(gè)PPO基因進(jìn)行熒光PCR表達(dá)檢測，由表5可知，LOC107810501基因被敲除后，煙草中未檢測到該基因的表達(dá)。在遵煙6號和K326的編輯后代中，未進(jìn)行打靶編輯的PPO基因（LOC107821546、LOC107786520、LOC107773093、LOC107787563、LOC107805360）相對表達(dá)量明顯下降（圖6、圖7）。這說明煙草PPO家族基因可能存在協(xié)同表達(dá)或者表達(dá)通路的關(guān)聯(lián)。

3 小結(jié)

煙草PPO基因和茄科其他植物類似，存在家族基因協(xié)同表達(dá)現(xiàn)象，因此對其活性水平進(jìn)行精準(zhǔn)的控制和改良有一定難度。同時(shí)，PPO可以將多酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，改變植物組織的生化特性，有助于抵抗病菌侵染和昆蟲取食，對于植物的抗病蟲有一定的作用，因此，將PPO活性控制在合理水平是較穩(wěn)妥的育種改良方案［9］。本研究在檢測、分析了野生型煙草品種遵煙6號和K326的PPO家族基因表達(dá)水平后，沒有選擇表達(dá)量最高的PPO基因進(jìn)行敲除，也是考慮PPO活性水平急劇下降后可能帶來的負(fù)向效應(yīng)。不同品種的PPO家族基因可能對PPO活性貢獻(xiàn)存在品種間差異，這表明在采用基因敲除技術(shù)進(jìn)行品種改良時(shí)，需要根據(jù)具體品種的PPO家族基因表達(dá)活性特征來制定特定的基因編輯方案。

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