摘要：為明確八角楓（Alangium chinense （Lour.） Harms）葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，通過(guò)Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)八角楓葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行組裝、注釋和結(jié)構(gòu)分析。利用mVISTA和Geneious軟件對(duì)八角楓、毛八角楓、高山八角楓、八角楓MG524996和八角楓NC044840葉綠體基因組進(jìn)行同源比對(duì)和共線性分析，采用MEGA 11軟件構(gòu)建植物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，八角楓完整的葉綠體基因組全長(zhǎng)156 672 bp，呈雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，GC占37.69%；葉綠體基因組共有130個(gè)編碼基因，包括81個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（PCGs）、38個(gè)tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)基因、8個(gè)rRNA基因和3個(gè)假基因，其在葉綠體基因組序列中占比分別為62.31%、29.23%、6.15%和2.31%。同源比對(duì)和共線性分析發(fā)現(xiàn)，5種植物（八角楓、其他4種八角楓屬植物）葉綠體基因組間具有高度相似性和共線性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，八角楓與高山八角楓親緣關(guān)系最為接近，暗示他們?cè)谶M(jìn)化上具有共線性，推測(cè)該八角楓為新亞種。

關(guān)鍵詞：葉綠體基因組；八角楓屬；近緣屬植物；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)：R931" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2025）01-0168-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.01.027 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Analysis of systemic development in the genus Alangium chinense and its related genera plants based on chloroplast genome

YANG Yu-xia1， LI Jing-ting 1， LI Ying1，SU Chen2，3，YAN Rui1，WEI Ze-chang1

（1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou" 730070， China；

2. Henan Key Laboratory of Eco-economic Woody Plant Germplasm Innovation and Utilization， Pingdingshan University， Pingdingshan" 467000， Henan，China； 3. College of Resource Environment and Tourism， Capital Normal University，Beijing" 100048，China）

Abstract： In order to clarify the structural characteristics and phylogenetic relationships of the chloroplast genome of Alangium chinense （Lour.） Harms， Illumina high-throughput sequencing technology was used to sequence the chloroplast genome of Alangium chinense， followed by assembly， annotation， and structural analysis. Using mVISTA and Geneous software， homologous alignment and collinearity analysis were performed on the chloroplast genome of Alangium chinense， Alangium kurzii Craib， Alangium alpinum， Alangium chinense MG524996， and Alangium chinense NC044840. A plant phylogenetic tree was constructed using MEGA 11 software. The results showed that the complete chloroplast genome of Alangium chinense was 156 672 bp in length， with a double-stranded circular structure and a GC proportion of 37.69%；the chloroplast genome consists of 130 coding genes， including 81 protein coding genes （PCGs）， 38 tRNA transport genes， 8 rRNA genes， and 3 pseudogenes， accounting for 62.31%， 29.23%， 6.15%， and 2.31% of the chloroplast genome sequence， respectively. Through homology comparison and collinearity analysis， it was found that the chloroplast genome of five plants （Alangium chinense and four other plants in the Alangium chinense genus） exhibited high similarity and collinearity.Phylogenetic analysis indicated that Alangium chinense was most closely related Alangium alpinum， suggesting their collinearity in evolution. It was speculated that Alangium chinense was a new subspecies.

Key words： chloroplast genome； Alangium chinense genus； related genera plants； systemic development

葉綠體是一種半自主細(xì)胞器，具有遺傳信息的表達(dá)系統(tǒng)，其染色體不受核基因的影響，主要由母系遺傳決定［1］。高等植物的葉綠體DNA是一種具有雙鏈?zhǔn)降姆忾]環(huán)形結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度隨著物種的不同而變化，它是繼核基因之后的第二大基因組。由于其遺傳信息豐富、相對(duì)分子質(zhì)量低、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速率適中、突變率低、遺傳穩(wěn)定性好，常用于物種鑒定、物種演化、物種親本分析、分子系譜地理［2］推斷、物種來(lái)源等方面的研究［3］。此外，葉綠體基因組信息還被廣泛用于不同種類植物的基因組學(xué)和植物系統(tǒng)發(fā)育方面研究［4］。

大多數(shù)植物葉綠體基因組都具有很強(qiáng)的保守性。全葉綠體基因組測(cè)序顯示，葉綠體基因組包含倒位重復(fù)區(qū)（IRA和IRB）、 小單拷貝（SSC）和大單拷貝（LSC）［5，6］。在漫長(zhǎng)的演化中，葉綠體的基因結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)某些變異［7］，如DNA片段的重疊和倒位等，然而并非全部的葉綠體都包含IR，例如少量的低等植物裸藻沒(méi)有IR，豌豆則沒(méi)有IR和DR，并且rRNA僅有1個(gè)拷貝［8］。

八角楓（Alangium chinense （Lour.） Harms）為八角楓科八角楓屬植物，是貴州的一種特色植物以及常用的苗藥，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、散瘀止痛等功效。八角楓具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛藥理活性，在涉及炎癥等疾病的治療中有較好的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值［9］。

本研究采用Illumina Hiseq 2000高通量測(cè)序技術(shù)，完成八角楓屬及近緣種屬葉綠體基因組測(cè)序、拼接和注釋以及基因組重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)分析和物理圖譜繪制，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。旨在進(jìn)一步了解八角楓的葉綠體基因結(jié)構(gòu)，為八角楓屬新物種的鑒定、種質(zhì)資源的保護(hù)、藥用價(jià)值、系統(tǒng)進(jìn)化、功能基因分析等方面提供分子基礎(chǔ)資料［10］。

1 材料與方法

1.1 材料

八角楓樣本取自湖北省隨州市廣水市大貴寺國(guó)家級(jí)森林公園的三潭風(fēng)景區(qū)（海拔908 m，31°45′01″N，113°46′33″E）。

1.2 葉綠體基因組測(cè)序及拼接

DNA樣本在北京源宜基因科技股份有限公司檢測(cè)，使用Illumina Hiseq 2000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。首先使用 SOAPdenovo 2.01［11］組裝序列，然后將組裝好的長(zhǎng)序列與近緣物種的葉綠體參考基因組進(jìn)行比較，利用BLAT36程序［12］確定等位基因序列之間的相對(duì)位置。根據(jù)等位基因的相對(duì)位置進(jìn)行拼接，糾正裝配錯(cuò)誤，從而獲得葉綠體基因組的全尺寸框架圖。使用 GapCloser 1.12 程序用高質(zhì)量的短序列填補(bǔ)等位基因序列中的空白，通過(guò)單代測(cè)序完成和確認(rèn)剩余的空白和可疑區(qū)域，從而獲得最終的葉綠體基因組序列。

1.3 葉綠體基因組序列注釋、提交和物理圖譜繪制

先用CpGAVAS［13］對(duì)八角楓葉綠體基因組進(jìn)行主要注釋，再使用DOGMA［14］（http：//dogma.ccbb.utexas.edu/） 進(jìn)行輔助注釋。根據(jù)注釋結(jié)果使用Organellar Genome DRAW［15］（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制葉綠體基因組圖譜。

1.4 葉綠體基因組重復(fù)序列分析

使用REPuter分析八角楓的長(zhǎng)重復(fù)序列，Hamming distance、Maximum computed P repeats、Minimal repeat size的參數(shù)分別設(shè)置為3、5 000、30［16］。使用MISA［17］對(duì)葉綠體基因組中的單序列重復(fù)序列（SSR）進(jìn)行分析，閾值和核苷酸參數(shù)分別設(shè)置為1、2、3、4、5、6和8、4、4、3、3、3，最小SSR間距為100 bp。

1.5 八角楓屬種間葉綠體基因組同源比對(duì)及共線性分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取八角楓屬4種植物（表1）的葉綠體基因組序列，與八角楓進(jìn)行基因組同源比對(duì)。首先利用在線工具CPGAVAS2對(duì)八角楓的葉綠體基因組序列進(jìn)行注釋，然后利用mVISTA在線軟件進(jìn)行同源比對(duì)，選擇Shuffle-LAGAN（全局比對(duì)）模式，以八角楓為參考基因組，將葉綠體基因組序列（fasta格式）及注釋文件上傳進(jìn)行比對(duì)。

利用Geneious 2023.2.1軟件基于Mauve多重基因組比對(duì)法將八角楓與從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的4種八角楓屬植物葉綠體基因組進(jìn)行共線性分析。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA 11軟件，選取與八角楓科親緣關(guān)系較相近的藍(lán)果樹(shù)科、桃金娘科、菱角科、瑞香科、胡頹子科等26種植物，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組測(cè)序、組裝、注釋

八角楓葉綠體基因組測(cè)序原始數(shù)據(jù)為1.854 G，raw reads為12.280 M，過(guò)濾后得到1.501 G（占80.9%）的有效數(shù)據(jù)和10.220 M（占83.2%）的clean reads，這些reads平均長(zhǎng)度為146.8 bp。其基因組為156 672 bp的雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)IR（25 950 bp，IRA和IRB）、1個(gè)SSC（18 593 bp）和1個(gè)LSC（87 179 bp）（圖1）。

八角楓葉綠體基因組中共有130個(gè)編碼基因，其中含有81個(gè)蛋白編碼基因（PCGs），在葉綠體所有基因序列中占62.31%，其次，有38個(gè)tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)基因 （29.23%）、8個(gè)rRNA基因 （6.15%）和3個(gè)假基因（2.31%） 。

2.2 八角楓葉綠體基因組功能及分類

根據(jù)基因功能不同將八角楓葉綠體基因分為遺傳系統(tǒng)基因、光合作用基因、功能未知基因和其他基因。每種功能有著不同的基因，這些基因大多與生物合成有關(guān)。在這些基因中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)PCG基因（rps12、 rps7、 rpl2、 rpl23、 ndhB、 ycf2、 ycf68、 ycf15、 ycf1），8個(gè)tRNA基因（trnH-GUG、 trnI-CAU、 trnL-CAA、 trnI-GAU、 trnV-GAC、 trnA-UGC、 trnR-ACG、 trnN-GUU），4個(gè)rRNA基因（rrn4.5、 rrn5、 rrn16、 rrn23）（表2）。

2.3 葉綠體基因組重復(fù)序列分析

利用REPuter軟件分析八角楓的長(zhǎng)重復(fù)序列，發(fā)現(xiàn)其含有正向重復(fù)序列（Forward repeats sequence，F(xiàn)R）、反 向 重 復(fù)序列（Reverse repeats sequence，RR）及回文重復(fù)序列（Palindrome repeats sequence，PR）。八角楓葉綠體的基因組共鑒定到64個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列，其中正向重復(fù)序列有30個(gè)（30～35 bp有15個(gè)、36～41 bp有4個(gè)、42～47 bp有 5個(gè)、 54～59 bp有2個(gè)、60～65 bp有4個(gè)）；反向重復(fù)序列有2個(gè)（30～395 bp）；回文重復(fù)序列有32個(gè)（30～4 349 bp有31個(gè)，21 631～25 950 bp有1個(gè)）。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）具有位點(diǎn)多態(tài)性，可開(kāi)發(fā)為分子標(biāo)記進(jìn)行物種鑒定。通過(guò)MISA對(duì)八角楓葉綠體基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在5種類型的120個(gè)SSRs，其中單核苷酸82個(gè)、二核苷酸27個(gè)、三核苷酸6個(gè)、四核苷酸4個(gè)、五核苷酸1個(gè)。

2.4 八角楓及其他4種八角楓屬植物種間葉綠體基因組同源比對(duì)

利用mVISTA軟件的 Shuffle-LAGAN 模式，將本研究中注釋的八角楓葉綠體基因組作為葉綠體基因組同源性分析的參考。結(jié)果（圖2）表明，5種植物（八角楓、其他4種八角楓屬植物）葉綠體基因組的基因組成和序列順序高度保守，但在petN-psbD、rps4-trnF、petA-psbJ、clpP-psbB基因區(qū)間內(nèi)以及ycf1、ycf2、rrn16等基因編碼區(qū)內(nèi)存在顯著差異。

2.5 八角楓及其他4種八角楓屬植物葉綠體基因組共線性分析

利用Geneious軟件對(duì)八角楓、毛八角楓、高山八角楓、八角楓MG524996和八角楓NC044840的葉綠體基因組序列進(jìn)行序列重組及共線性分析。Mauve多基因組分析結(jié)果（圖3）顯示，5種植物（八角楓、其他4種八角楓屬植物）的葉綠體基因組具有2個(gè)局部共線區(qū)（LCBs），不存在大片段的重排或倒置，基因組間具有高度相似性和共線性。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

因?yàn)榘私菞骺苾H有1個(gè)八角楓屬，所以本研究選取了與八角楓科親緣關(guān)系相近的藍(lán)果樹(shù)科、桃金娘科、菱角科、瑞香科、胡頹子科等26種植物的葉綠體基因組序列。以胡頹子科胡頹子屬的木半夏和沙棗為外類群，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，各科的物種都聚成一支；在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，27種植物可以劃分為3條主要分支。與胡頹子科胡頹子屬植物（Elaeagnus multiflora、Elaeagnus glabra、Elaeagnus angustifolia）相區(qū)別，包括八角楓在內(nèi)的八角楓科、藍(lán)果樹(shù)科等24種植物聚成獨(dú)立的一支，其支持率均為100%。在此基礎(chǔ)上，又將其分為3個(gè)二級(jí)分支，其中，瑞香科和其屬下的狼毒屬、瑞香屬、沉香屬等幾個(gè)屬（包括Stellera chamaejasme、Daphne genkwa、Daphne retusa、Aquilaria yunnanensis、Aquilaria sinensis）組成了一個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)，支持率均為100%。

八角楓與八角楓MG524996、高山八角楓、毛八角楓、八角楓NC044840聚為一小支，支持率均為100%，其中八角楓與高山八角楓是親緣關(guān)系最近的姐妹類群，推測(cè)它們之間存在著共同的演化關(guān)系。

3 討論

八角楓作為貴州的特色植物及常用的苗藥，在散瘀止痛、炎癥治療中具有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)八角楓葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝、注釋及分析，結(jié)果表明，其基因結(jié)構(gòu)為雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀分子，葉綠體基因組的長(zhǎng)度為156 672 bp，共編碼130個(gè)基因，包括81個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（PCGs）、38個(gè)tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)基因、8個(gè)rRNA基因和3個(gè)假基因，其在葉綠體基因組序列中占比分別為62.31%、29.23%、6.15%和2.31%，蛋白質(zhì)編碼基因的數(shù)量最多，且其GC含量為37.69%，與楊小英等［16］的研究結(jié)果相似。通過(guò)REPuter軟件對(duì)八角楓葉綠體基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，共有64個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列（正向重復(fù)序列、反向重復(fù)序列、回文重復(fù)序列所占的比例分別為46.9%、3.1%、50.0%），其結(jié)果與稀花八角楓和伏毛八角楓相似［15］。

SSR位點(diǎn)通常被用于物種鑒定，通過(guò)MISA檢測(cè)出5種類型共120個(gè)SSRs，其中單核苷酸82個(gè)、二核苷酸27個(gè)、三核苷酸6個(gè)、四核苷酸4個(gè)、五核苷酸1個(gè)。五核苷酸的類型為CAAGA；單核苷酸中以A/T居多，分別為29、50個(gè)，分析結(jié)果與植物葉綠體基因組SSR序列組成規(guī)律一致［18］。同源比對(duì)結(jié)果表明，八角楓、毛八角楓、高山八角楓、八角楓MG524996和八角楓NC044840葉綠體基因組的基因組成和序列順序高度保守，但在petN-psbD、rps4-trnF、petA-psbJ、clpP-psbB基因區(qū)間內(nèi)以及ycf1、ycf2、rrn16等基因編碼區(qū)內(nèi)存在顯著差異。共線性分析表明，" " "5種植物（八角楓、其他4種八角楓屬植物）的葉綠體基因組具有2個(gè)局部共線區(qū)（LCBs），不存在大片段的重排或倒置，基因組間具有高度相似性和共線性。

通過(guò)比較八角楓科及相近科27個(gè)相似植物物種（如八角楓、毛八角楓和高山八角楓）的全葉綠體基因組序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示八角楓和高山八角楓的親緣關(guān)系最為密切，表明這兩個(gè)物種之間存在共同的進(jìn)化關(guān)系。同源比對(duì)、共線性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果均表明，本試驗(yàn)所研究八角楓與NCBI中已存在的八角楓屬八角楓不同亞種葉綠體基因組間存在顯著差異，推測(cè)其為八角楓屬八角楓的不同亞種。本研究結(jié)果既揭示了八角楓屬及八角楓科近緣屬各物種之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)又為八角楓屬新物種鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)、八角楓藥用價(jià)值、功能基因分析等提供了分子依據(jù)。

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