摘 要：為了解信陽市羅山縣MS流行狀況和流行株的分子特征，本研究應(yīng)用PCR方法對羅山縣部分蛋雞養(yǎng)殖場進行雞滑液囊支原體病原檢測，并對陽性樣品VlhA基因進行序列分析。結(jié)果表明，從48份樣品檢測出3份MS陽性樣品；VlhA基因序列分析表明，3個流行株與國內(nèi)流行的K基因型MS參考株具有高度相似性；VlhA基因推導(dǎo)氨基酸序列分析表明，3個流行株與國內(nèi)流行的MS具有高度同源性；氨基酸變異位點分析發(fā)現(xiàn)，H2 MS陽性樣品在第43、45位出現(xiàn)突變與缺失。研究結(jié)果為羅山地區(qū)MS流行病學(xué)研究提供了一定的參考。

關(guān)鍵詞：雞滑液囊支原體；PCR檢測；VlhA基因；序列分析能

禽支原體病主要由雞敗血支原體（Mycoplasma gallisepticum， MG）和雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae， MS）引起，是影響?zhàn)B禽業(yè)中一種極為重要的疾病。它可導(dǎo)致家禽體重增長減少、飼料轉(zhuǎn)化效率下降、產(chǎn)蛋量減少、孵化率降低、胚胎死亡率增加、胴體廢棄率上升、預(yù)防和治療成本增加，從而造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。雞滑液囊支原體病是由滑液囊支原體引起的普遍存在于全球養(yǎng)殖場內(nèi)的一種疾病，養(yǎng)殖環(huán)境中的各種因素如雞群密度、繁殖季節(jié)和環(huán)境變化等都對該病的流行有很大影響。該病一旦發(fā)生，將會對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[2]。雞滑液囊支原體病的主要癥狀包括關(guān)節(jié)滲出性滑液囊炎和腱鞘炎、呼吸道癥狀、生長緩慢、死亡率增加，尤其是引發(fā)產(chǎn)蛋下降、蛋殼品質(zhì)降低以及蛋殼尖端缺陷（Eggshell apex abnormalities， EAA）等一系列問題，備受大家關(guān)注[3]。

近年來，國內(nèi)外MS的發(fā)生率不斷增加，不同年齡、品種和地區(qū)均可發(fā)生，特別是嗜輸卵管MS的發(fā)生，給國內(nèi)家禽養(yǎng)殖企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]。目前，MS只有1個血清型，根據(jù)Jeffery等[5]建立的可變脂蛋白凝血素 A（VlhA）5′ 端序列分析方法，目前已發(fā)現(xiàn)了A～K等16種基因型[6]。VlhA基因測序分析已成為研究雞滑液囊支原體的重要方法之一，為雞滑液囊支原體病的防控提供了更準確、科學(xué)的數(shù)據(jù)支持[7]。本研究目的是應(yīng)用PCR方法進行MS病原檢測及VlhA基因序列分析，弄清信陽市羅山地區(qū)MS流行狀況和流行株的分子特征，為當?shù)仉u滑液囊支原體病的防控提供更為準確的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 本試驗樣品采集自信陽市羅山縣高店鄉(xiāng)、尤店鄉(xiāng)、東鋪鎮(zhèn)、潘新鎮(zhèn)等4個地區(qū)疑似發(fā)生MS感染的蛋雞養(yǎng)殖場，通過對有明顯呼吸系統(tǒng)病變、產(chǎn)蛋量和產(chǎn)蛋性能及產(chǎn)蛋質(zhì)量下降的病雞進行咽拭子采集，共采集48份樣品，標記后進行實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 TAE電泳緩沖液、LB培養(yǎng)基、DNA凝膠快速回收試劑盒等，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Rapid Taq Master Mix、FastPure@ViralDNA/RNA Mini Kit Pro試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒與連接轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參考NYT5553-2015合成MG、MS PCR檢測引物。參考Jeffery等[5]設(shè)計合成MS VlhA基因擴增引物。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體信息見表1。

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2025）02-0019-07

收稿日期：2024-06-27

基金項目：信陽農(nóng)林學(xué)院科技服務(wù)團隊項目（2022FWTD）；信陽農(nóng)林學(xué)院青年教師科研基金項目（QN2023019）；

信陽農(nóng)林學(xué)院科技創(chuàng)新團隊資助項目（KJCXTD-201901）

第一作者：李迎曉（1981—），副教授，從事獸醫(yī)病原微生物與免疫學(xué)研究，E-mail： liyingxiao81@163.com

通信作者：焦鳳超（1979—），副教授，從事獸醫(yī)病原微生物與免疫學(xué)研究，E-mail： fengchaojiao@163.comm

1.2.2 樣品DNA提取 將采集的氣管或輸卵管棉拭子按照FastPure@ViralDNA/RNA Mini Kit Pro試劑盒說明書提取樣品DNA，將提取后的DNA模板放置-20 ℃保存。

1.2.3 病原PCR檢測 利用特異性MGF、MGR引物檢測敗血性支原體；利用MSF、MSR引物檢測滑液囊支原體。PCR反應(yīng)體系為：2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 延伸5 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸1 min。

1.2.4 VlhA基因的PCR擴增和序列分析 利用滑液囊支原體分型特異性引物配置50 μL的PCR反應(yīng)體系：2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL，PCR擴增程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 延伸5 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸1 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。將陽性條帶的膠回收產(chǎn)物分別連接5 min TOPO-Blunt Cloning Kit，將重組質(zhì)粒用M13F/R通用引物PCR檢測無誤后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用DNAStar軟件和MEGA軟件與GenBank中公布的參考毒株VlhA基因和推導(dǎo)氨基酸序列進行相似性比對和遺傳進化樹的構(gòu)建。參考菌株序列信息見表2。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣品的PCR檢測

PCR結(jié)果表明：從信陽市羅山縣4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的部分蛋雞養(yǎng)殖場中采集的48份樣品中，有3份樣品PCR擴增出了200 bp左右條帶（圖1），與預(yù)期片段大小相符，檢出率為6.25%，初步證明3份陽性樣品疑似雞滑液囊支原體感染，分別命名為H1 MS、H2 MS、H3 MS。

2.2 VlhA基因的PCR擴增

對3份陽性樣品進行VlhA基因進行PCR擴增，均擴增出400 bp左右條帶，與預(yù)期片段大小相符，結(jié)果顯示見圖2。

2.3 VlhA基因序列分析

序列分析顯示，流行株H1 MS、H2 MS、H3 MS與國內(nèi)參考株KU572343、KU572326、KU572314、KU572344、KU572324、KU572379、KJ606947、FM164344、MH679910核苷酸相似性較高，在96.4%～100%之間，而與其他基因型參考株的相似性（94.0%～96.4%）較低，其中H3 MS與KU572343、KU572326、KU572314、KU572344、KU572324這5株來自國內(nèi)的K基因型的參考株相似性最高，為100%；其他2株流行株與這5株參考株相似性稍低（圖3）。由圖4可知，3個流行株與國內(nèi)K型參考株KU572343、KU572326、KU572314、KU572344、KU572324、KU572379親緣關(guān)系最近，處于同一分支。因此表明3株陽性樣品毒株均屬于K基因型。

2.4 VlhA氨基酸序列分析

推導(dǎo)氨基酸序列比對結(jié)果顯示，流行株H1 MS、H2 MS、H3 MS與國內(nèi)的KU572344、KU572326、KU572343、KU572314、KU572324氨基酸相似性最高，在95.2%～100%之間，處于同一分支，親緣關(guān)系最近（圖5）。

氨基酸變異位點分析顯示，3株流行株與其他16株參考株VlhA氨基酸位點存在13處差異位點，特別是H2 MS與其他菌株相比存在43位（D→N）、45位（V→/）變異見表3。

3 討論

近年來，滑液囊支原體引發(fā)的疫情報道在我國、日本和美洲國家的養(yǎng)雞場內(nèi)屢見不鮮，一度成為高頻率傳染疾病[8]。Sun等[9]對2010—2015年間中國16個省的9 773個地方雞群進行MS流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明，MS在中國地方種雞中廣泛流行，在種雞胚胎中MS的感染率高達16.29%。

MS可以水平傳播，但其經(jīng)蛋垂直傳播的危害更大。邵延福等[10]發(fā)現(xiàn)蛋雞感染MS后，可導(dǎo)致種蛋在孵化后期死亡，或孵出攜帶MS的弱雞而成為重要的傳染源。雞在不同階段感染MS，會有不同的臨床表現(xiàn)。MS可以在雞體內(nèi)長期潛伏，從外觀正常雞的器官中也能分離出滑液囊支原體，在不良環(huán)境因素的刺激下，雞群將迅速發(fā)病，持續(xù)感染給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。被MS感染的病雞精神差、羽毛粗亂、不運動，患病雞滑膜囊出現(xiàn)囊腫，足底腫脹，有潰瘍或結(jié)痂，甚至不能站立和行走。產(chǎn)蛋雞群感染后出現(xiàn)產(chǎn)蛋突然下降、蛋殼質(zhì)量差和無殼蛋、軟殼蛋增多等癥狀[11]。本研究通過對信陽市羅山縣高店鄉(xiāng)、尤店鄉(xiāng)、東鋪鎮(zhèn)、潘新鎮(zhèn)等4個地區(qū)的部分蛋雞養(yǎng)殖場的病雞群進行觀察記錄，發(fā)現(xiàn)部分病雞群的鼻腔與眼睛出現(xiàn)粘性分泌液，蛋雞出現(xiàn)產(chǎn)蛋量下降、蛋殼質(zhì)量下降以及產(chǎn)出“太陽蛋”等癥狀，部分病雞還出現(xiàn)部分關(guān)節(jié)腫大、腱鞘與滑膜囊出現(xiàn)囊腫病變，雞冠多呈現(xiàn)蒼白、萎縮等，這些臨床表現(xiàn)與感染雞滑液囊支原體病的臨床癥狀高度相似，進一步進行PCR檢測，檢出3份雞滑液囊支原體陽性樣品，證實了發(fā)病雞群感染雞滑液囊支原體并伴有明顯的臨床癥狀，為地方雞滑液囊支原體流行病學(xué)提供了參考。

目前MS存在16種不同的基因型（A～K）。其中A～J基因型均由國外研究所發(fā)現(xiàn)，而K基因型在我國首次發(fā)現(xiàn)[12]。謝迪等[6]于2016—2019年從江蘇、安徽、山東、河南、河北、寧夏、黑龍江、湖北等8個省份疑似發(fā)生MS感染的雞場采集樣品，進行MS菌株的分離鑒定，結(jié)果共獲得48株MS分離株，其中46株為K基因型。Sui等[13]于2017—2019年間對中國中部地區(qū)258個雞群進行了MS調(diào)查，共分離出129株MS菌株，81.4%分離株為L型。分析發(fā)現(xiàn)，2017年的流行類型包括I型和L型；2018年的類型增加到5種（A、D、E、I、L型），2019年增加到6種（A、D、E、I、J、L型），說明中國中部地區(qū)MS的基因型具有多樣性。翟路峰等[14]對2019—2022年在我國河南、河北、山東、安徽、江蘇 5個省份收集的152份疑似MS感染的雞病料進行MS分離鑒定和基因分型，結(jié)果顯示：共分離到29株MS菌株，除其中1株為E型外，其余28株均為L型。以上結(jié)果說明我國不同區(qū)域存在不同基因型MS菌株，迫切需要加強家禽群中MS的實時監(jiān)管控制。

本研究對采集自信陽羅山縣部分地區(qū)的MS陽性樣品菌株進行PCR目的基因擴增，并對不同地方的參考菌株進行VlhA基因序列比對，進一步開展推導(dǎo)氨基酸序列分析，并構(gòu)建分子遺傳進化樹，研究結(jié)果表明3株陽性樣品菌株均與國內(nèi)基因分型為K基因型的參考株KU572326、KU572314、KU572344、KU572324、KU572379、KU572343同源性最高，表明羅山地區(qū)流行的MS基因分型屬K基因型，說明當?shù)亓餍兄甑膫魅驹慈匀粊碜試鴥?nèi)[15]，因此應(yīng)加強傳播途徑、防控措施等方面的進一步研究。

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PCR Detection and VlhA gene sequence Analysis of Mycoplasma Synoviae in Chickens from Luoshan County， Xinyang City

LI Yingxiao， YIN Lei， HU Yuman， ZHAO Yu， JIAO Fengchao

（College of Animal Science and Technology， Xinyang Agricultural and Forestry University，

Xinyang 464000，China）

Abstract： The study aimed to understand the prevalence and molecular characteristics of Mycoplasma synoviae （MS） strains in some egg layer farms in Luoshan County， Xinyang City. PCR methods were applied to detect MS in the samples， and the positive samples' VlhA gene was cloned for sequence analysis. The results showed that out of 48 samples， 3 were positive for MS. The analysis of the VlhA gene sequences indicated that the three prevalent strains had a high degree of similarity with the domestic K genotype MS reference strains. The deduced amino acid sequence analysis of the VlhA gene revealed a high degree of homology between the three prevalent strains and the domestic MS strains. Analysis of the amino acid mutation sites found that the H2 MS positive sample had mutations and deletions at positions 43 and 45. The findings provide a reference for the epidemiological study of MS in the Luoshan area.

Keywords： Mycoplasma synoviae; PCR detection; VlhA gene; Sequence analysis