摘 要：本文研究阿拉伯糖-豌豆肽美拉德反應(yīng)中間體的抗氧化活性，并與豌豆分離蛋白酶解液以及豌豆肽完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行比較。結(jié)果表明，豌豆肽中間體的DPPH自由基清除活性、還原力和Fe2+螯合能力均高于酶解液。中間體的DPPH自由基清除活性比完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物低，還原力接近完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，F(xiàn)e2+螯合能力比完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物強，濃度為6.0 mg·mL-1時，中間體的Fe2+螯合率達(dá)到96.64%。說明阿拉伯糖-豌豆肽美拉德反應(yīng)中間體可作為一種新型抗氧化劑應(yīng)用于食品中。

關(guān)鍵詞：豌豆肽；美拉德反應(yīng)中間體；抗氧化

Study on the Antioxidant Activity of Aarabinose-Pea Peptides Maillard Reaction Intermediates

ZHOU Xue， FANG Xin， LIU Yuan， WAN Suqin， CHEN Hong*

（Jiangsu Institute for Food and Drug Control， Nanjing 210008， China）

Abstract： In this paper， the antioxidant activity of arabinose-pea peptide Maillard reaction intermediates was studied， and compared with pea isolate protein hydrolysate and pea peptide complete Maillard reaction products. The results showed that the DPPH radical scavenging activity， reducing power and Fe2+ chelating ability of pea peptide intermediates were higher than those of the enzymatic hydrolysate. The DPPH radical scavenging activity of the intermediate was lower than that of the complete Maillard reaction product， the reducing power was close to that of the complete Maillard reaction product， and the Fe2+ chelating ability was stronger than that of the complete Maillard reaction product， and the Fe2+ chelating rate of the intermediate reached 96.64% at a concentration of 6.0 mg·mL-1. These results indicated that arabinose-pea peptide Maillard reaction intermediate can be used as a new antioxidant in food.

Keywords： pea-peptides; Maillard reaction intermediates; antioxidation

對于含脂類的食品，特別是含有不飽和脂肪酸的，易發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生不良風(fēng)味且會縮短食品的保質(zhì)期。目前在食品中經(jīng)常使用人工合成抗氧化劑來抑制脂類的氧化，防止食品變質(zhì)。但人工合成抗氧化劑的安全性受到了質(zhì)疑，因此有必要尋求一種新型抗氧化劑。

美拉德反應(yīng)可劃分為3個發(fā)展階段，包括起始發(fā)展階段、第二發(fā)展階段和最后發(fā)展階段[1]。起始發(fā)展階段的主要反應(yīng)是氨基與還原糖的羰基發(fā)生縮合反

應(yīng)，醛糖經(jīng)Amadori重排生成Amadori重排產(chǎn)物（Amadori Rearrangement Products，ARPs）；酮糖則經(jīng)Heyns重排生成Heyns重排產(chǎn)物，將美拉德反應(yīng)起始發(fā)展階段的產(chǎn)物統(tǒng)稱為美拉德反應(yīng)中間體。美拉德反應(yīng)中間體已被報道發(fā)揮著重要的抗氧化作用[2]。ARPs能夠清除自由基的原因是自由基電子能夠與醛糖殘基上的羰基或與羰基相鄰的羥基碳形成分子內(nèi)氫鍵[3]，產(chǎn)生穩(wěn)定的自由基中間體，從而導(dǎo)致自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)被打斷，氧化反應(yīng)被遏止。豌豆分離蛋白作為一種低過敏性的植物蛋白，深受消費者青睞，通過酶解和后續(xù)的美拉德反應(yīng)，既可以提高蛋白利用率，又可以改善酶解液的苦味。因此，進(jìn)一步系統(tǒng)研究豌豆肽美拉德反應(yīng)中間體抗氧化性能可拓寬其在食品中的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蛋白含量約為85%的豌豆蛋白，山東煙臺東方蛋白科技有限公司；復(fù)合蛋白酶、氨肽酶，安徽強旺調(diào)味食品有限公司；鐵氰化鉀、氯化鐵、菲咯嗪、氯化亞鐵、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基等，分析純，Sigma-Aldrich試劑（中國）有限公司（上海）；D-阿拉伯糖，食品級，上海源葉生物科技有限

公司。

電子天平、pH計，METTLER TOLEDO公司；高速冷凍離心機，EPPENDORF公司；A360型紫外可見分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆分離蛋白酶解液的制備

配制10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的豌豆分離蛋白水溶液，100 ℃熱變性30 min，冷卻至室溫。調(diào)節(jié)pH值為8.0左右，同時將溫度調(diào)整為（60±2）℃，然后添加復(fù)合蛋白酶（3 500 U·g-1底物），酶解4 h，調(diào)節(jié)溫度至（50±2）℃，并添加氨肽酶（400 U·g-1底物），酶解4 h。酶解結(jié)束后，100 ℃加熱10 min以達(dá)到滅酶的目的，降低溫度為22 ℃左右，離心后取上清液備用。

1.2.2 豌豆肽美拉德反應(yīng)中間體的制備

將豌豆蛋白酶解液和阿拉伯糖按20∶3的質(zhì)量比混合均勻，用6 mol·L-1 NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，80 ℃反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后立即用冰水浴終止反應(yīng)，所得產(chǎn)物即為美拉德反應(yīng)中間體（MRIs）[4]。

1.2.3 豌豆肽完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

參照1.2.2項方法配制反應(yīng)液，用6 mol·L-1 NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，120 ℃反應(yīng)120 min，反應(yīng)結(jié)束后立即用冰水浴終止美拉德反應(yīng)，所得產(chǎn)物即為完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）。

1.2.4 抗氧化能力的測定

（1）DPPH自由基清除能力測定。在試管中加入1 mL樣品溶液、3 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液，渦旋1 min，22 ℃暗光放置30 min，離心取上清液，測定其在517 nm的吸光值。用濃度為95%的乙醇溶液替代DPPH乙醇作為對照。按公式（1）計算DPPH自由基清除率。

（1）

式中：Ay為試驗品吸光值；Ad為對照品吸光值；Ab為空白吸光值（用去離子水代替樣品溶液）。

（2）還原力測定。添加1 mL的樣品、2.5 mL pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]溶液于試管中，渦旋1 min。（50±2）℃加熱20 min，降低溫度至室溫，繼續(xù)添加2.5 mL 10%的三氯乙酸，離心。取2.5 mL上清液，并加入2.5 mL去離子水和

2.5 mL 0.1%FeCl3溶液混勻。等待10 min并測定溶液在700 nm處的吸光值A(chǔ)700。

（3）螯合Fe2+能力的測定。在試管中加入1 mL樣品溶液、1.85 mL去離子水和0.05 mL 2 mmol·L-1 FeCl2溶液，混合均勻，室溫下放置30 s，再吸取

0.1 mL菲咯嗪溶液（濃度5 mmol·L-1）于試管中，

22 ℃反應(yīng)10 min。將去離子水作為空白對照，測定溶液在562 nm處的吸光值。螯合率計算公式為

（2）

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2019（Microsoft，Redmond，

WA，USA）制表和畫圖。所有試驗至少重復(fù)3次，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除能力

由圖1可知，在濃度為0.1～1.0 mg·mL-1時，MRPs的DPPH自由基清除率較高，且在0.9 mg·mL-1時，其清除率分別是中間體（MRIs）和酶解液的

1.53倍和8.65倍。這可能是因為類黑素具有高DPPH自由基清除能力，隨著美拉德反應(yīng)程度的加深，MRPs中類黑素的含量最高，因此MRPs的DPPH自由基清除能力最強[5]。中間體的DPPH自由基清除率一直高于酶解液的DPPH自由基清除率，這是因為中間體不僅含有ARPs，還含有肽，二者均可以提供氫原子，促進(jìn)穩(wěn)定的非自由基形式DPPH-H的生成[3]，而酶解液中僅有肽能提供氫原子。

2.2 還原力

由圖2可知，在濃度為0.5～3.0 mg·mL-1時，酶解液的還原力最弱且?guī)缀鯖]有變化，當(dāng)濃度為

3.0 mg·mL-1時，中間體（MRIs）和MRPs的還原力約為酶解液的4.4倍，說明通過與阿拉伯糖的美拉德反應(yīng)可以增強酶解液的還原力。在該濃度范圍內(nèi)，中間體和MRPs的還原力與其濃度呈線性正相關(guān)，且線性系數(shù)R2均大于0.99，說明兩者的還原力基本上相當(dāng)。這可能是因為中間體中的ARPs能提供電子[3]，而MRPs中棕色化合物的羥基和吡咯基團也可以提供電子，均能將鐵離子還原為亞鐵離子[6]。

圖1 酶解液、MRIs、MRPs的DPPH自由基清除率

圖2 酶解液、MRIs、MRPs的還原力

2.3 Fe2+螯合能力

由圖3可知，在1.0～10.0 mg·mL-1的濃度水平下，酶解液的Fe2+螯合能力沒有明顯增強；中間體（MRIs）和MRPs在1.0～6.0 mg·mL-1濃度水平下的Fe2+螯合能力隨濃度增加而增強，之后趨于穩(wěn)定。3種樣品的Fe2+螯合能力從強到弱依次為中間體、酶解液、MRPs，且當(dāng)濃度達(dá)到6.0 mg·mL-1時，中間體的Fe2+螯合率達(dá)到96.64%。MRPs的Fe2+螯合能力可能歸因于其中的羥基或吡咯基團以及類黑素，類黑素作為陰離子親水聚合物，可以與金屬陽離子結(jié)合形成穩(wěn)定的配合物。豌豆分離蛋白酶解液中含有的大量小肽，肽序列中的谷氨酸、賴氨酸和精氨酸等有助于提高Fe2+的螯合活性，因此酶解液的Fe2+螯合能力較強。中間體的Fe2+螯合能力不僅與含有上述可提高Fe2+螯合活性的氨基酸有關(guān)，而且與Fe2+也能夠與ARPs中的這些氨基酸片段結(jié)合，同時還可以與ARPs中的阿拉伯糖片段上的羰基氧配位有關(guān)，因此其Fe2+的螯合能力最強。

3 結(jié)論

本文選擇DPPH自由基清除率、還原力和螯合Fe2+能力3個指標(biāo)評判豌豆肽美拉德反應(yīng)中間體的抗氧化作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿拉伯糖-豌豆肽美拉德反應(yīng)中間體的DPPH自由基清除活性、還原力和Fe2+螯合能力都高于豌豆蛋白酶解液，說明通過美拉德反應(yīng)，物質(zhì)的抗氧化活性得到了提高?？傊?，豌豆肽美拉德反應(yīng)中間體具有一定的抗氧化能力，可作為一種抗氧化劑在食品生產(chǎn)中應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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[2]盧思蕓.肽美拉德反應(yīng)中間體形成示蹤機制和水相制備[D].無錫：江南大學(xué)，2020.

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[5]劉曉丹，肖瀛，吳金鴻，等.加熱對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要成分及其抗氧化活性的影響[J].糧食與油脂，2024，37（3）：139-143.

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