摘要：NAC是植物特有轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫等方面發(fā)揮作用。為挖掘紫花苜蓿（Medicago sativa）響應(yīng)干旱等非生物脅迫的NAC轉(zhuǎn)錄因子，本研究利用生物信息學(xué)方法在‘中苜4號(hào)’紫花苜?；蚪M中鑒定出143個(gè)NAC家族轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，紫花苜蓿MsNAC基因在染色體上不均勻分布，MsNAC基因存在片段重復(fù)，并與大豆（Glycine max （Linn.） Merr.）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）存在共線性關(guān)系，基因保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析表明MsNAC基因多數(shù)含有Motif1，Motif3保守基序及3～6個(gè)外顯子。大多數(shù)MsNAC蛋白定位于細(xì)胞核中。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明MsNACs聚類為8個(gè)亞家族。順式作用元件分析表明MsNAC基因含有響應(yīng)干旱及脫落酸、生長(zhǎng)素等順式作用元件。熒光定量分析結(jié)果顯示部分MsNAC基因響應(yīng)干旱、鹽脅迫及脫落酸處理，大部分MsNAC候選基因在干旱、鹽及ABA處理后上調(diào)表達(dá)。本研究結(jié)果可為紫花苜?？购怠⒛望}分子育種提供候選基因。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；NAC；轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)；非生物脅迫；表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：S514.9""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）08-2440-19

Identification of Alfalfa NAC Gene Family and Analysis of Their

Expression Patterns under Abiotic Stress

ZOU Wei-peng， ZHAI Jia-xing， LI Di-na， HUANG Jie-qiong， GUO Kang-jie，

CEN Hui-fang*， ZHU Hui-sen*， XU Tao

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：The NAC transcription factors are specific to plants and play a crucial role in regulating plant growth，development，and response to abiotic stresses. A total of 143 NAC family transcription factors were identified in the ‘Zhongmu No.4’ alfalfa （Medicago sativa） genome using bioinformatics methods，specifically in response to abiotic stress such as drought. The distribution of MsNAC genes on the chromosomes of alfalfa was found to be uneven，with fragment repetition and collinear relationships with soybean （Glycine max） and Medicago truncatula. Gene conserved motifs and gene structure analysis revealed that most MsNAC genes contain Motif1 and Motif3 conserved motifs and 3～6 exons，most MsNAC proteins are localized in the nucleus. The results of phylogenetic tree analysis showed that MsNACs were clustered into 8 subfamilies. The analysis of cis-acting elements showed that MsNAC genes contain cis-acting elements to drought，abscisic acid and auxin. Fluorescence quantitative PCR analysis showed that some MsNAC genes were responsive to drought，salt stress，and ABA treatment，most MsNAC candidate genes were up-regulated after drought，salt and ABA treatment. These findings provide valuable candidate genes for breeding alfalfa with improved drought and salt tolerance.

Key words：Alfalfa;NAC;Transcription factor;Bioinformatics;Abiotic stress;Expression pattern

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中容易受到干旱、鹽堿等非生物脅迫和病蟲(chóng)害等生物脅迫的危害，植物通過(guò)調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物的生化代謝途徑及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程來(lái)抵御及適應(yīng)脅迫對(duì)其產(chǎn)生的影響。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的基因家族，也是植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［1-3］。NAC蛋白具有高度保守的N端DNA結(jié)合區(qū)以及可變的C端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，N端大約由150個(gè)氨基酸殘基組成且又分為高度保守的A，C，D及多變的B，E共5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，不同亞結(jié)構(gòu)域發(fā)揮不同的功能，其中A亞結(jié)構(gòu)域與功能二聚體有關(guān)，B，E亞結(jié)構(gòu)域與蛋白質(zhì)功能的多樣性有關(guān)，C，D亞結(jié)構(gòu)域則與DNA結(jié)合有關(guān)［4-5］。自1996年Souer等在矮牽牛中分離到第一個(gè)屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的NAM后，越來(lái)越多的NAC轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)掘出來(lái)，并且證明其在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫、參與次生物質(zhì)代謝、影響細(xì)胞發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用［6-8］。如在水稻（Oryza sativa）中OsNAC2基因可以結(jié)合生長(zhǎng)素失活相關(guān)基因GH3.6/GH3.8和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因ARF25以及細(xì)胞分裂素氧化酶基因的啟動(dòng)子，從而調(diào)控水稻生長(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素途徑，影響水稻根系生長(zhǎng)［9］；西瓜（Citrullus lanatus）ClNAC68轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)抑制ClINV和ClGH3.6的表達(dá)正向調(diào)控西瓜的含糖量和種子發(fā)育［10］；在小麥（Triticum aestivum）中過(guò)表達(dá)TaNACL-D1轉(zhuǎn)錄因子可以增強(qiáng)小麥對(duì)赤霉病的抗逆性［11］；草莓（Fragaria×ananassa）FaRIF轉(zhuǎn)錄因子是草莓成熟以及色素生成和糖分積累的關(guān)鍵調(diào)控因子［12］；在番茄（Solanum lycopersicum）中，NAC轉(zhuǎn)錄因子NOR-like1通過(guò)調(diào)節(jié)番茄細(xì)胞層數(shù)和細(xì)胞面積來(lái)調(diào)節(jié)果實(shí)大?。?3］；油菜（Brassica rapa）BraNAC87基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了油菜葉片葉綠素的降解及花青素積累，調(diào)控活性氧的積累和細(xì)胞死亡［14］。

NAC基因在多種植物中完成功能驗(yàn)證及全基因組分析，包括擬南芥（Arabidopsis thaliana）［15］、玉米（Zea mays）［16］、梭梭（Haloxylon ammodendron）［17］、月季（Rosa chinensis）［18］、山茶（Camellia sinensis）［19］等。在擬南芥中鑒定出117個(gè)NAC基因，其中AtNAC092調(diào)控由鹽脅迫引發(fā)的衰老過(guò)程［20］；玉米中鑒定出148個(gè)非冗余的NAC基因，ZmNAC20能提高玉米耐旱性［21］；在月季中鑒定出116個(gè)NAC基因，其中RcNAC091直接靶向RcWRKY71啟動(dòng)子區(qū)域激活RcWRKY71表達(dá)，RcWRKY71正向調(diào)控月季脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)及月季耐旱性［22］；在獼猴桃中鑒定出142個(gè)NAC基因，其大多調(diào)控獼猴桃果實(shí)成熟過(guò)程［23］；在山茶中鑒定出104個(gè)NAC基因，過(guò)表達(dá)CsNAC28可增強(qiáng)山茶耐旱性［19］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科苜蓿屬多年生牧草，是我國(guó)栽培面積最大的牧草之一，具有營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)高、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、適口性好的特點(diǎn)，被稱為“牧草之王”［24-25］。隨著我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展，優(yōu)質(zhì)豆科牧草的需求量逐年升高。我國(guó)紫花苜蓿多種植于干旱半干旱地區(qū)種植區(qū)，干旱遏制了我國(guó)紫花苜蓿種植及生產(chǎn)［26］。因此培育耐旱紫花苜蓿新品種是發(fā)展我國(guó)畜牧業(yè)的關(guān)鍵。目前，多個(gè)品種紫花苜蓿的全基因組已得到解析，為進(jìn)一步挖掘分析抗旱相關(guān)基因家族提供了便利。NAC基因在調(diào)控其他植物生長(zhǎng)發(fā)育與非生物脅迫響應(yīng)等方面已得到驗(yàn)證，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)紫花苜蓿MsNAC基因家族進(jìn)行鑒定和分析，并對(duì)其在干旱、鹽脅迫及脫落酸（Abscisic acid，ABA）處理下的響應(yīng)模式進(jìn)行研究，為后續(xù)進(jìn)一步探究NAC基因在紫花苜蓿中的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 NAC轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

利用紫花苜?；蚪M數(shù)據(jù)（https：//figshare.com/s/fb4ba8e0b871007a9e6c）和NAC轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件，用hmmsearch命令鑒定紫花苜蓿NAC家族成員；并且從Phytozom（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov）和Tair（https：//www.arabidopsis.org）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取擬南芥、水稻及蒺藜苜蓿的基因組文件，與紫花苜?；蚪M進(jìn)行Blast比對(duì)，得到紫花苜蓿NAC蛋白序列。以上獲得的序列進(jìn)行合并及去冗余分析，并且利用NCBI-conserved domain（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）及SMART（https：//smart.embl.de/）和Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的鑒定，再根據(jù)NAM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列長(zhǎng)度約為150 bp進(jìn)行篩選［27］，最終獲得紫花苜蓿NAC轉(zhuǎn)錄因子。

1.2 蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位分析

利用ExPasy（https：//www.expasy.org）在線蛋白質(zhì)分析工具ProtParam和ProtScale預(yù)測(cè)氨基酸數(shù)目、分子量等信息。利用Cell-Ploc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）及Wolf-psort（https：//wolfpsort.hgc.jp）對(duì)蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.3 基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)基序分析

利用保守基序在線預(yù)測(cè)工具M(jìn)EME（https：//meme-suite.org/meme）對(duì)MsNAC蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，保守基序數(shù)設(shè)置為10，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)；從紫花苜蓿注釋文件中獲得MsNAC的基因結(jié)構(gòu)信息，使用TBtools工具將MsNAC的基因結(jié)構(gòu)（外顯子-內(nèi)含子、保守結(jié)構(gòu)域）及保守基序結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析

使用MEGA7.0軟件對(duì)紫花苜蓿MsNAC基因和蒺藜苜蓿MtNAC基因的氨基酸序列的多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰接法（Neighbor-Joining），泊松校正，成對(duì)刪除，1000次Bootstrap重復(fù)［28］，利用iTOL（https：//itol.embl.de/）及Evolview（https：//www.evolgenius.info/evolview/）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)美化。

1.5 順式作用元件分析

從紫花苜蓿注釋文件中選取MsNAC基因起始密碼子上游2000 bp的序列，利用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）工具預(yù)測(cè)并分析啟動(dòng)子順式作用元件。將預(yù)測(cè)獲得的數(shù)據(jù)利用TBtools工具進(jìn)行可視化分析［29］。

1.6 染色體定位及基因共線性分析

從紫花苜?；蜃⑨屛募蝎@取紫花苜蓿的染色體信息及MsNAC基因的染色體定位信息，根據(jù)MsNAC基因在染色體上的位置進(jìn)行編號(hào)命名。利用TBtools工具對(duì)MsNAC基因進(jìn)行共線性及基因重復(fù)事件和染色體定位的可視化分析［30］。

1.7 紫花苜蓿MsNAC基因的組織表達(dá)特異性及響應(yīng)不同非生物脅迫的表達(dá)模式分析

從紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（PRJNA450305）中獲取不同非生物脅迫下紫花苜蓿的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過(guò)Hisat2建立索引，將紫花苜?；蚪M數(shù)據(jù)與RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，使用StringTie計(jì)數(shù)，計(jì)算每百萬(wàn)條閱讀映射的轉(zhuǎn)錄本（Transcript per million，TPM）值，以log2（TPM+1）值表述紫花苜蓿MsNAC基因不同非生物脅迫下的響應(yīng)模式，并利用TBtools進(jìn)行可視化［31］。

植物材料為‘中苜1號(hào)’紫花苜蓿，于2023年10月種植于蛭石∶泥炭=1∶1的基質(zhì)中，置于人工氣候箱中，光周期為光照∶黑暗=16 h∶8 h，培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為60%。待幼苗生長(zhǎng)至4周齡，取出植株于1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中緩苗24 h，于1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中分別進(jìn)行干旱脅迫（15% PEG-6000）、鹽脅迫（250 mmol·L-1 NaCl）和ABA處理（150 μmol·L-1）。分別取脅迫處理不同時(shí)間下（0 h，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h）紫花苜蓿幼苗同一部位葉片提取RNA進(jìn)行qRT-PCR分析。

總RNA提取采用植物RNA提取試劑盒（0416-50，北京華越洋生物科技有限公司），利用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度，利用PrimeScriptRTreagen kit with gDNA eraser（Perfect Real Time）（RR047，TaKaRa）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Primer 5設(shè)計(jì)引物，引物列表見(jiàn)表1，其中MsActin為內(nèi)參基因。qRT-PCR采用Bio-Rad CFX96系統(tǒng)，每個(gè)反應(yīng)體系含有cDNA模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）10 μL和ddH2O 7 μL。qRT-PCR反應(yīng)循環(huán)條件為：95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，10 s；40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量使用差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）=2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.8 數(shù)據(jù)處理

qRT-PCR數(shù)據(jù)使用Excel 2022及SPSS 26.0軟件進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿NAC家族候選基因鑒定

在‘中苜4號(hào)’紫花苜?；蚪M中鑒定NAC基因家族成員，通過(guò)HMM及結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定出143個(gè)非冗余MsNAC基因，按照在染色體上的分布位置依次命名為MsNAC001～MsNAC143（表2）。對(duì)紫花苜蓿MsNAC蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，MsNAC的理化性質(zhì)存在較大差異，其中分子量最大的是MsNAC016，編碼1034個(gè)氨基酸，分子量為117.27 kDa，分子量最小的是MsNAC123，編碼150個(gè)氨基酸，分子量為17.60 kDa。蛋白疏水性指數(shù)介于-1.02（MsNAC067）和-0.05（MsNAC010）之間，表明MsNAC蛋白均為親水性蛋白。蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)（Isoelectric point，pI）介于4.16（MsNAC056）和10.24（MsNAC041）之間，70個(gè)（48.9%）MsNAC蛋白為酸性蛋白（pIlt;6.5），55個(gè)（38.4%）MsNAC蛋白為堿性蛋白（pIgt;7.5）。對(duì)MsNAC蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MsNAC蛋白主要定位于細(xì)胞核中，共有139個(gè)MsNAC定位于細(xì)胞核中，占總數(shù)的97.2%，少數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體中，如MsNAC004定位于細(xì)胞質(zhì)中，MsNAC003，MsNAC010，MsNAC121定位于葉綠體中，推測(cè)大多數(shù)MsNAC轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)功能（表2）。

2.2 紫花苜蓿MsNAC基因家族保守基序及結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME工具對(duì)紫花苜蓿保守基序（Motif）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，依次命名為Motif1～Motif10（圖1A）。如圖1B所示，保守基序在不同MsNAC蛋白中存在分布差異，大多數(shù)Motif保守程度較高，少部分Motif存在特異性。其中Motif1存在于絕大多數(shù)MsNAC成員中，僅MsNAC068及MsNAC079中不存在Motif1，除MsNAC033，MsNAC052，MsNAC064，MsNA-C105及MsNAC112外，其余成員都擁有Motif3，其中Motif8，9，10在MsNAC中保守性較差，分別只存在于11，12及38個(gè)MsNAC成員中，大多數(shù)MsNAC成員都包含Motif1～Motif7。

保守結(jié)構(gòu)域分析表明，MsNAC家族成員共鑒定出7種結(jié)構(gòu)域，其中所有MsNAC蛋白都含有NAM結(jié)構(gòu)域，而MsNAC121含有Glyco_hydro_100結(jié)構(gòu)域，Glyco_hydro_100結(jié)構(gòu)域主要存在于堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因INV（Invertase）中，該基因能夠?qū)⒄崽撬鉃槠咸烟呛凸?，并且參與糖分運(yùn)輸，從而調(diào)控植株生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫［32］。MsNAC044和MsNAC050含有Zinc_peptidase結(jié)構(gòu)域，而MsNAC115，MsNAC129和MsNAC056分別具有PHA02682和PHA03269結(jié)構(gòu)域，MsNA-C127和MsNAC035，MsNAC043分別具有RPA_2b-aaRSs_OBF和LIM結(jié)構(gòu)域（圖1C），LIM結(jié)構(gòu)域蛋白是一種肌動(dòng)結(jié)合蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白束的形成［33］。這些結(jié)構(gòu)域可能賦予這些MsNAC基因特殊的生物學(xué)功能。

利用TBtools對(duì)MsNAC基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)可視化分析，結(jié)果顯示MsNAC基因的外顯子數(shù)目在2～17個(gè)之間，其中外顯子數(shù)目在3～6個(gè)的MsNAC成員有124個(gè)，MsNAC16基因含有17個(gè)外顯子，MsN-AC11，MsNAC38，MsNAC88，MsNAC97，MsNAC101，MsNAC123，MsNAC143基因僅含有2個(gè)外顯子（圖2）。

2.3 紫花苜蓿MsNAC家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步研究紫花苜蓿MsNAC基因家族的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)紫花苜蓿MsNAC蛋白與模式植物蒺藜苜蓿的NAC蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，紫花苜蓿的143個(gè)MsNAC蛋白被分為8個(gè)亞族。其中第Ⅴ亞族包含的NAC家族成員最多，包含34個(gè)MsNAC及35個(gè)MtNAC。第Ⅱ亞族包含的NAC家族成員最少，包含12個(gè)MsNAC及4個(gè)MtNAC。在Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ和Ⅶ亞族中，MsNAC成員與MtNAC成員較均勻分布，而在第Ⅰ，Ⅷ亞族中MsNAC成員明顯多于MtNAC成員（圖3）。綜上，紫花苜蓿MsNAC家族成員與蒺藜苜蓿MtNAC家族成員分布較為均勻，顯示紫花苜蓿與蒺藜苜蓿親緣關(guān)系較近且存在相似蛋白質(zhì)。

2.4 紫花苜蓿MsNAC基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

為進(jìn)一步探究MsNAC基因的生物學(xué)功能，對(duì)MsNAC基因起始密碼子（ATG）上游2000 bp進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，共鑒定出包括脫落酸響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、應(yīng)急防御響應(yīng)元件等22種順式作用元件，其中共有108個(gè)MsNAC基因啟動(dòng)子上含有脫落酸響應(yīng)元件，134個(gè)MsNAC基因含有光響應(yīng)元件，66個(gè)成員含有應(yīng)急防御響應(yīng)元件，99個(gè)成員含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，7個(gè)成員含有細(xì)胞周期調(diào)控元件，54個(gè)成員擁有低溫響應(yīng)元件，65個(gè)成員擁有MYB結(jié)合位點(diǎn)響應(yīng)干旱脅迫的順式作用元件（圖4），這些順式作用元件可能在MsNAC參與非生物脅迫及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

2.5 紫花苜蓿MsNAC基因染色體定位及共線性分析

依據(jù)紫花苜蓿MsNAC基因在染色體上的位置及順序依次命名，由染色體定位圖可知（圖5），133個(gè)MsNAC基因不均勻地定位到32條染色體上，chr8.1染色體上分布的MsNAC基因最多，每條染色體含有至少2個(gè)MsNAC基因，另外，有10個(gè)MsNAC基因未定位到紫花苜蓿染色體上。

利用MCScanX軟件分析MsNAC家族成員的共線性關(guān)系，如圖6所示，在紫花苜蓿MsNAC基因家族中共鑒定出40個(gè)基因片段重復(fù)事件，表明MsNAC基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了一定的基因復(fù)制事件，使得MsNAC基因家族迅速擴(kuò)張。

在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步探究NAC基因家族在不同植物進(jìn)化過(guò)程中基因的親緣關(guān)系，對(duì)紫花苜蓿以及大豆、蒺藜苜蓿、擬南芥中的NAC基因進(jìn)行共線性分析。結(jié)果表明，49個(gè)MsNAC基因與擬南芥存在共線性關(guān)系，72個(gè)MsNAC基因與大豆存在共線性關(guān)系，73個(gè)MsNAC基因與蒺藜苜蓿存在共線性關(guān)系（圖7）。紫花苜蓿NAC基因與蒺藜苜蓿和大豆親緣關(guān)系更近，說(shuō)明進(jìn)化過(guò)程中NAC基因在豆科植物中保守演替。

2.6 紫花苜蓿MsNAC基因在不同組織及非生物脅迫處理下的表達(dá)模式分析

為探究MsNAC基因在紫花苜蓿不同組織中的表達(dá)模式，利用‘中苜1號(hào)’紫花苜蓿RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如圖8A所示，有12個(gè)MsNAC基因在花中有較高的表達(dá)水平，其中MsNAC040及MsNAC054的表達(dá)量明顯高于其他紫花苜蓿MsNAC基因；有18個(gè)MsNAC基因在莖中具有較高的表達(dá)量，其中MsNAC057及MsNAC042在莖中的表達(dá)量最高；有17個(gè)MsNAC基因在葉片中有較高的表達(dá)水平，MsNAC031及MsNAC065在葉中擁有最高的基因表達(dá)量，而在花中的表達(dá)量最低，說(shuō)明發(fā)生基因重復(fù)事件的基因具有相似的組織表達(dá)模式。另外，有6個(gè)MsNAC基因在花、莖、葉中的表達(dá)量無(wú)顯著差異。大部分MsNAC基因在紫花苜蓿不同組織中均有表達(dá)但存在組織特異性，說(shuō)明MsNAC基因功能存在多樣性，在調(diào)控紫花苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。

為進(jìn)一步分析MsNAC基因在不同非生物脅迫下的響應(yīng)模式，分析了MsNAC在干旱、鹽及脫落酸脅迫處理下的RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［34］。結(jié)果顯示，不同MsNAC在不同非生物脅迫處理下存在不同的響應(yīng)模式。干旱脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，MsNAC036，MsNAC025，MsNAC070和MsNAC-006基因的表達(dá)量逐漸升高，在24 h達(dá)到最大值，而MsNAC040，MsNAC056，MsNAC037和MsNA-C098基因的表達(dá)量降低，MsNAC057，MsNAC042和MsNAC074等基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖8B）。在鹽脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，MsNAC036，MsNAC044等基因的表達(dá)量上調(diào)，MsNAC042，MsNAC129和MsNAC019等基因的表達(dá)量下調(diào)，MsNAC015，MsNAC094等基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)（圖8C）。在ABA處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MsNAC139，MsNA-C063和MsNAC031等基因的表達(dá)量上調(diào)，MsNAC088，MsNAC118等基因的表達(dá)量下調(diào)，MsNAC013，MsNAC057和MsNAC050等基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖8D）。另外，部分基因在不同脅迫處理下表達(dá)模式相似，如MsNAC036，MsNAC025和MsNAC044等基因在干旱脅迫和鹽脅迫下均隨著脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，MsNAC040，MsNAC129等基因在干旱脅迫和鹽脅迫下隨著脅迫時(shí)間的增加均下調(diào)表達(dá)。表明MsNAC基因可能在紫花苜蓿響應(yīng)不同非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步確認(rèn)紫花苜蓿MsNAC基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式，選取了9個(gè)MsNAC基因驗(yàn)證其對(duì)干旱、鹽脅迫和ABA處理的響應(yīng)情況。如圖9所示，在干旱脅迫下，隨著脅迫時(shí)間增加，MsNAC045，MsNAC138基因呈上調(diào)表達(dá)，MsNAC042，MsNAC053，MsNAC056和MsNA-C074基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)；MsNAC006，MsNAC036和MsNAC128基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢(shì)，其中MsNAC036，MsNAC045，MsNAC056，MsNAC128和MsNAC138基因的表達(dá)量在干旱脅迫下顯著上調(diào)，說(shuō)明其在紫花苜蓿干旱脅迫應(yīng)答中可能發(fā)揮重要作用。在鹽脅迫下，隨著脅迫時(shí)間增加，MsNAC036，MsNAC042和MsNAC045基因先上調(diào)表達(dá)而后下調(diào)表達(dá)；MsNAC006，MsNAC053，MsNAC056，MsNAC074，MsNAC128和MsNAC-138基因表達(dá)量波動(dòng)較大，但總體對(duì)鹽脅迫有響應(yīng)，其中MsNAC045基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組熱圖分析一致（圖10）。在ABA處理下，MsNAC074基因表達(dá)量隨著脅迫處理時(shí)間增加呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，在24 h達(dá)到最大值；MsNAC006，MsNAC036，MsNAC045，MsNAC053，MsNAC056和MsNA-C128基因表達(dá)量隨脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)波動(dòng)較大，MsNAC042，MsNAC138基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)（圖11）。

3 討論

NAC作為植物特有轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用，如紫花苜蓿MsNAC051能夠與MsP5CS和MsPOD-P7的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，直接激活其表達(dá)，增強(qiáng)煙草的抗旱性［35］。目前已在可可（Theobroma cacao）及蒺藜苜蓿中分別鑒定出102及97個(gè)NAC基因［36-37］，本研究在紫花苜?！熊?號(hào)’基因組中鑒定出143個(gè)MsNAC基因，分布在32條染色體上，明顯多于擬南芥［15］及蒺藜苜蓿中鑒定到的NAC基因數(shù)量，可能是因?yàn)樽匣ㄜ俎橥此谋扼w，擁有更多同源基因。

紫花苜蓿和蒺藜苜蓿NAC基因系統(tǒng)發(fā)育分析可知，MsNAC基因聚類到8個(gè)亞家族中，其中第V家族包含最多的MsNAC成員，位于同族的MsNAC成員擁有相似的Motif及基因結(jié)構(gòu)，在辣椒（Capsicum annuum）［38］及梅花（Prunus mume）［39］中都有相似現(xiàn)象，說(shuō)明MsNAC基因在進(jìn)化過(guò)程中較為保守。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明，大多數(shù)MsNAC蛋白定位在細(xì)胞核中，說(shuō)明MsNAC蛋白主要在細(xì)胞核中發(fā)揮功能，與擬南芥AtNAC蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果相似［20］。同時(shí)，基因共線性分析表明紫花苜蓿MsNAC基因與大豆及蒺藜苜蓿NAC基因在進(jìn)化過(guò)程中親緣關(guān)系更近，表明NAC基因在豆科植物進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守，說(shuō)明了紫花苜蓿與蒺藜苜蓿等有更近的親緣關(guān)系，在紅車軸草［40］（Trifolium pratense）中有類似結(jié)果。相同基因功能域預(yù)示著可能發(fā)揮類似的生物學(xué)功能。紫花苜蓿MsNAC蛋白與辣椒［38］、草莓［12］、玉米［16］的NAC蛋白都擁有典型的NAM結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明MsNAC蛋白可能在紫花苜蓿響應(yīng)非生物脅迫及生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮作用。不同基因結(jié)構(gòu)也影響基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的功能，大多數(shù)MsNAC基因的外顯子數(shù)量在3～6個(gè)，但序列長(zhǎng)度不同，說(shuō)明MsNAC的基因結(jié)構(gòu)較為相似，并且與擬南芥及蒺藜苜蓿NAC基因結(jié)構(gòu)相似。

基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件預(yù)示著該基因可能在不同脅迫下發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，MsNAC基因在啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)與植株生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，可能與紫花苜蓿抵抗非生物脅迫有重要關(guān)聯(lián)［36］。如MsNAC001，MsNAC50，MsNAC079和MsNAC106基因含有脫落酸及生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，與紫花苜蓿MsNAC051研究結(jié)果相似［35］。表明它們可能在多種激素應(yīng)答及生理代謝過(guò)程發(fā)揮作用，而MsNAC034及MsNAC085擁有干旱響應(yīng)元件及應(yīng)急防御響應(yīng)元件，說(shuō)明它們可能在植物抵御干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

NAC基因在其他物種中的功能也有研究，在水稻中，OsNAC3是鹽脅迫及ABA信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)控因子［41］；有研究表明，GmNAC1～4是調(diào)控大豆根瘤高氮響應(yīng)的中心調(diào)控因子［42］；在擬南芥中，AtNAC096與ABF2及ABF4相互作用，激活擬南芥對(duì)干旱及滲透脅迫中ABA誘導(dǎo)基因的表達(dá)［43］；香蕉（Musa acuminata）中MaNAC1隨著冷脅迫時(shí)間的增加，表達(dá)量升高，說(shuō)明MaNAC1是參與香蕉響應(yīng)冷脅迫的重要基因［44］。

本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法，將鑒定出的MsNAC與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行整合，分析出與干旱、鹽、ABA處理有關(guān)的MsNAC基因家族成員，同時(shí)通過(guò)分析紫花苜蓿在干旱、鹽和ABA處理后MsNAC基因的表達(dá)模式，表明MsNAC可能參與多種脅迫響應(yīng)。其中，大多數(shù)MsNAC在干旱、鹽及ABA處理下呈上升趨勢(shì)，僅少量MsNAC呈下降趨勢(shì)，如MsNAC128及MsNAC138在干旱脅迫24 h后達(dá)到最大值，而MsNAC042及MsNAC074在干旱脅迫12 h后達(dá)到最大值，與山茶CsNAC9表達(dá)模式相似［45］；大多MsNAC基因在鹽脅迫處理后在12 h達(dá)到最大值，表明他們擁有相似的表達(dá)模式，MsNAC138在鹽脅迫下與ZmNAC59表達(dá)水平相似［45］；而MsNAC128在ABA處理后在24 h表達(dá)量下調(diào)，MsNAC053及MsNAC056在ABA處理下與CsNAC9響應(yīng)模式相似，說(shuō)明它們可能參與脫落酸調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育［45］。隨后用qRT-PCR驗(yàn)證了MsNAC基因能夠響應(yīng)干旱、鹽脅迫及ABA處理，說(shuō)明MsNAC基因是紫花苜蓿抵抗非生物脅迫的重要基因，參與紫花苜蓿響應(yīng)非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程。本研究可為后續(xù)針對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行抗逆性改良提供候選基因。

4 結(jié)論

本研究從‘中苜4號(hào)’紫花苜?；蚪M中鑒定出143個(gè)擁有完整NAM結(jié)構(gòu)域的MsNAC基因，被分為8個(gè)亞族，大都含有3～6個(gè)外顯子并在其啟動(dòng)子區(qū)域含有大量響應(yīng)脫落酸、生長(zhǎng)素等激素及干旱和寒冷等脅迫的順式作用元件。同時(shí)鑒定出40個(gè)基因重復(fù)事件，并與蒺藜苜蓿、大豆及擬南芥存在共線性關(guān)系。MsNAC基因在紫花苜蓿中存在組織特異性表達(dá)，參與調(diào)控紫花苜蓿對(duì)干旱、鹽、ABA的響應(yīng)過(guò)程，并在干旱、鹽脅迫及ABA處理后大都上調(diào)表達(dá)，其中MsNAC036，MsNAC045及MsNAC053是響應(yīng)干旱及鹽脅迫的關(guān)鍵基因。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）