摘要：為提高發(fā)酵菌株的木糖利用速率，以嗜熱毀絲霉為體系，利用遺傳學(xué)手段及轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，探究絲狀真菌嗜熱毀絲霉木糖代謝的調(diào)控機制。結(jié)果表明，在嗜熱毀絲霉中，轉(zhuǎn)錄因子XlnR能夠正向調(diào)控木糖代謝和轉(zhuǎn)運以及半纖維酶的表達，是木糖條件下孢子萌發(fā)的必需因子。在木糖條件下，突變體ΔxlnR孢子喪失了萌發(fā)的能力，并且菌絲木糖利用速率顯著降低，而過表達xlnR 使得木糖利用速率提升14.2%。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，敲除xlnR導(dǎo)致木聚糖水解酶基因、木糖轉(zhuǎn)運蛋白及代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。全局調(diào)控因子Cre-1是木糖及葡萄糖代謝的抑制因子，敲除cre-1 后顯著提升嗜熱毀絲霉木糖和葡萄糖利用速率；同時，Cre-1可直接抑制xlnR 及自身的表達。通過過表達木糖代謝激活因子XlnR編碼基因xlnR，同時敲除抑制因子Cre-1編碼基因cre-1，嗜熱毀絲霉木糖利用速率提高100%。以上研究結(jié)果為生物質(zhì)高效利用底盤細胞的創(chuàng)建提供了良好的出發(fā)菌株。

關(guān)鍵詞：嗜熱毀絲霉；木糖代謝；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；Cre-1；XlnRdoi：10.13304/j.nykjdb.2023.0151

中圖分類號：S182；Q933 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）12007711

生物質(zhì)資源是地球上最豐富的可再生有機原料，實現(xiàn)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物燃料以及生物化學(xué)品，是解決目前發(fā)酵原料短缺、實現(xiàn)雙碳目標(biāo)的關(guān)鍵。木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素構(gòu)成，三者之間通過共價鍵和氫鍵緊密纏繞連接[1]，形成堅硬的、難降解的剛性結(jié)構(gòu)。在生物質(zhì)中纖維素含量為38%～50%，半纖維素含量為23%～32%[2]，二者通過多種碳水化合物活性酶協(xié)同作用進行降解[3]，降解后產(chǎn)生的纖維寡糖由β-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase， BGLs）降解成葡萄糖，木寡糖由β-木糖苷酶 （β-xylosidase， BXLs） 降解成木糖。傳統(tǒng)生物質(zhì)利用技術(shù)主要包括預(yù)處理、纖維素酶生產(chǎn)和木質(zhì)纖維素酶解糖化以及產(chǎn)品發(fā)酵等工藝[4]。目前，國內(nèi)外纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)主要體系均為絲狀真菌，包括里氏木霉（Trichoderma reesei）[5]、嗜熱毀絲霉（Myceliopthorathermophila ） 以及青霉菌 （Penicillium）[67]。經(jīng)過遺傳改造以及人工誘變后，工業(yè)菌株嗜熱毀絲霉和里氏木霉的纖維素酶產(chǎn)量均達到100 g·L-1[8-10]，顯著降低了生物質(zhì)發(fā)酵成本。生物質(zhì)水解液的主要成分為葡萄糖和木糖，實現(xiàn)生物質(zhì)全糖的高效率利用是生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。盡管研究者已經(jīng)鑒定了木糖主要代謝途徑[11]，但對于其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未明晰。

絲狀真菌是纖維素酶的主要生產(chǎn)菌，同時也被開發(fā)為重要的有機酸等工業(yè)發(fā)酵菌種[7， 1213]。絲狀真菌在利用生物質(zhì)水解糖的過程中，由于碳分解代謝物阻遏效應(yīng)（carbon cataboliterepression，CCR）會優(yōu)先利用葡萄糖，而木糖利用則嚴(yán)重滯后[14]。研究發(fā)現(xiàn)，碳阻遏調(diào)控因子Cre-1（CreA）是Cys2His2型轉(zhuǎn)錄因子[1516]，已被證實存在于多種絲狀真菌中，如里氏木霉（T. reesei）[17]。Cre-1通過調(diào)控糖轉(zhuǎn)運蛋白基因、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、糖代謝途徑基因和纖維素酶基因的表達來實現(xiàn)對生物質(zhì)中纖維素和半纖維素降解的調(diào)控[13，17]，同時，Cre-1可直接與木聚糖酶、半乳糖苷酶和阿拉伯聚糖酶基因及其代謝途徑關(guān)鍵酶基因的啟動子結(jié)合[15，17]。但是，Cre-1對絲狀真菌木糖代謝的調(diào)控機制尚未明晰，有待進一步研究。在絲狀真菌中，XlnR （Xyr1/Xlr1）是木聚糖酶和纖維素酶的主要調(diào)控因子[1819]。在粗糙脈孢菌和嗜熱毀絲霉中，XlnR 主要參與木聚糖降解和木糖代謝[2021]。在黑曲霉中，XlnR 的同源蛋白Xyr1[22]參與調(diào)控20多個編碼半纖維素酶基因和纖維素酶基因的表達[23]，被認(rèn)為是纖維素酶和半纖維素酶基因表達的主要激活因子[15]，該基因缺失后，導(dǎo)致所有誘導(dǎo)物喪失對纖維素酶的誘導(dǎo)作用，同時削弱誘導(dǎo)物對木聚糖水解酶基因和阿拉伯聚糖水解酶基因的誘導(dǎo)作用[2425]。

嗜熱毀絲霉為天然高效降解纖維素菌種，具有發(fā)酵溫度高、纖維素降解能力強、蛋白分泌水平高、能夠天然利用五碳糖和六碳糖等優(yōu)勢，是生產(chǎn)工業(yè)酶和生物基化學(xué)品的優(yōu)秀底盤微生物[26]。目前，研究者已開發(fā)了基于CRISPR/Cas9 和CRISPR/Cpf1的基因組編輯技術(shù)[27-29]，為嗜熱毀絲霉的遺傳改造奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。嗜熱毀絲霉已被開發(fā)為有機酸及有機醇細胞工廠，實現(xiàn)了生物質(zhì)直接發(fā)酵合成目標(biāo)產(chǎn)品[30]，即真菌整合生物煉制（consolidated bioprocessing，CBP）技術(shù)[31-33]。在真菌CBP 技術(shù)中，產(chǎn)酶、生物質(zhì)酶解和目標(biāo)產(chǎn)品合成均由單一菌種來完成，極大降低了生物質(zhì)煉制成本。因此，本研究以嗜熱毀絲霉為體系，研究其木糖代謝調(diào)控機制，通過人工干預(yù)使嗜熱毀絲霉的木糖利用效率顯著提升，為實現(xiàn)生物質(zhì)全糖高效率利用奠定了理論及技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和試劑 嗜熱毀絲霉ATCC 42464購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type CultureCollection，ATCC）；質(zhì)粒ppK2-Bar-GFP、pAN52-PtrpC-TN、pGEX-4T-1和AT-U6-gRNA均保藏于本實驗室；大腸桿菌感受態(tài)Mach1-T1和BL21 （DE3）購于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；PCR試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和GST磁珠純化試劑盒均購于康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；GibsonAssembly?克隆試劑盒和RNA純化回收試劑盒購于紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；非變性聚丙烯酰胺凝膠購于賽默飛世爾科技公司；新霉素（neomycin）和草銨膦 （glufosinate ammonium） 購于北京吉普賽生物技術(shù)有限公司，氨芐青霉素購于Amresco；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropylthio-β-galactoside， IPTG） 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、木糖和阿拉伯糖購于Sigma公司；木二糖和木三糖購于Megazyme公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g；定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

50×vogel’salt：檸檬酸鈉130 g，硝酸鉀126 g，磷酸二氫銨144 g，磷酸二氫鉀80 g，七水硫酸鎂10 g，二水氯化鈣5 g，微量元素5 mL。100 mL微量元素溶液含5 g C6H8O·7H2O，5 g ZnSO4·7H2O，1 g Fe（NH4）2（SO4）·6H2O，0.25 g CuSO4·5H2O，0.05 gMnSO4·H2O，0.05 g H3BO3，0.05 g NaMnO4·2H2O，0.1 mg·mL-1的生物素溶液2.5 mL；定容至1 L，加入1 mL氯仿作為保護劑，室溫保存。

2%葡萄糖/木糖/阿拉伯糖培養(yǎng)基：1 × vogel’salt 1 L， 碳源（葡萄糖、木糖或阿拉伯糖）20 g，115 ℃滅菌25 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 靶基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建：在聯(lián)合基因組研究所（Joint Genome Institute，JGI）網(wǎng)站查找Mycth_2310145 （xlnR） 和Mycth_2310085 （cre-1）序列信息，按照文獻[31]方法確定PAM序列，以嗜熱毀絲霉基因組DNA為模板，利用表1中引物擴增xlnR 和cre-1 的5’和3’片段。以p0380-bar 質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物（bar-F/R）并擴增PtrpC-bar 片段；以p0380-neo 質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物（neo-F/R）并擴增PtrpC-neo 片段。使用Gibson Assembly?克隆試劑盒分別將xlnR 的5’片段、3’片段和PtrpC-neo片段連接到用 BamHⅠ和EcoRⅠ 切開的ppK2-Bar-GFP 載體中，獲得質(zhì)粒 donor-xlnR-neo。類似地，利用cre-1 基因的5’和3’片段以及PtrpC-bar 片段，構(gòu)建質(zhì)粒donor-cre-1-bar。靶向xlnR 和cre-1的sgRNA由嗜熱毀絲霉的U6啟動子控制，以ATU6-gRNA 質(zhì)粒為模板，以引物 （U6p-F/U6p-cre-1-R、cre1-gRNA-F/gRNA-R）擴增U6p-cre-1 和cre-1-gRNA 片段。二者融合獲得sgRNA 片段后，將其克隆到pJET1.2/blunt 載體上，得到U6p-cre-1-sgRNA重組質(zhì)粒。類似的，設(shè)計引物 U6p-F/U6pxlnR-R 和xlnR-gRNA-F/gRNA-R 分別獲得U6pxlnR和 xlnR-gRNA片段，二者融合獲得sgRNA片段后，將其插入pJET1.2/blunt載體，得到重組質(zhì)粒U6p-xlnR-sgRNA。以Cas9 為模板，引物為cas-F/R，PCR擴增出Cas9表達盒。

靶基因過表達質(zhì)粒構(gòu)建：設(shè)計引物OE xlnRF/R，以嗜熱毀絲霉cDNA為模板，擴增xlnR 片段；將Ptef-1 啟動子、翻譯延長因子Tef-1（translationelongation factor Tef-1）啟動子和xlnR 片段插入pAN52-PtrpC-TN 載體（Spe Ⅰ 和 BamH Ⅰ 雙酶切），獲得過表達質(zhì)粒pAN52-ptef-1-xlnR-PtrpCneo-TN。

1.2.2 嗜熱毀絲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及驗證 嗜熱毀絲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照文獻[3132]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因敲除，將sgRNA片段、donor片段和Cas9片段以1∶1∶1混合，濃縮后轉(zhuǎn)化到野生型或突變體原生質(zhì)體中。在靶基因過表達過程中，將10 μg線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到嗜熱毀絲霉原生質(zhì)體中，并用相應(yīng)的抗生素進行篩選，在35 ℃培養(yǎng)5 d 后，挑取少量菌絲于裂解緩沖液中，沸水浴20 min，高速離心（10 000 r·min-1，10 min）后加入150 μL滅菌水，作為模板使用。后續(xù)利用PCR驗證獲得陽性轉(zhuǎn)化子，驗證引物詳見表2。

1.2.3 突變體的形態(tài)學(xué)表征 將3 μL孢子懸液（1×104 cell·μL-1）接種到含有2%碳源（葡萄糖、木糖或阿拉伯糖）的固體培養(yǎng)基中，置于45 ℃條件下培養(yǎng)，觀察菌絲長勢，實時拍照記錄。

1.2.4 嗜熱毀絲霉糖利用分析 將成熟孢子接種到2% 葡萄糖或木糖液體培養(yǎng)基，接種量為106cell·mL-1，45 ℃下培養(yǎng)18 h，而后收集菌絲并用滅菌水洗滌3次。將菌絲接種于24孔板中，每孔接種3 mL 菌絲，分別加入木糖 （xylose）、木二糖（xylobiose） 和木三糖 （xylotriose），終含量為5 g·L-1，45 ℃、 700 r·min-1培養(yǎng)24 h。

1.2.5 凝膠遷移試驗 （electrophoretic mobilityshift assay， EMSA）

①獲取融合蛋白：以嗜熱毀絲霉野生型DNA為模板，用表1中的引物（ cre-1-emsa-F/R 和xlnR-emsa-F/R） 擴增xlnR 和cre-1 片段，而后插入經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后的載體pGEX-4T-1 中，分別獲得重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-xlnR 和pGEX-4T-1-cre-1。將重組質(zhì)粒及對照質(zhì)粒pGEX-4T-1 轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3） 中，37 ℃ 200 r·min-1 培養(yǎng)至OD 值為0.38～0.42；而后加入20 μL 1 mmol·L-1 IPTG，15 ℃ 200 r·min-1 低溫誘導(dǎo)20 h；收集菌體后低溫破碎，并使用GST磁珠純化試劑盒純化出融合GST標(biāo)簽的目的蛋白。

②獲取探針：以嗜熱毀絲霉野生型基因組作為模板，利用PCR 擴增相應(yīng)基因的啟動子區(qū)片段，引物詳見表3。

③ 反應(yīng)體系：50 mmol·L-1 MgCl2 2 μL、10 mg·mL-1 BSA 1 μL、50%甘油2 μL、Protein （0～200 nmol·L-1） 1 μL、探針（10 ng·μL-1） 1 μL，最后用ddH2O補到20 μL。將反應(yīng)體系在25 ℃條件下孵育30 min。

④反應(yīng)程序：預(yù)電泳150 V 40 min，沖洗膠孔；正式電泳150 V 50～60 min；電泳結(jié)束后，小心取出變性膠，使用SYBR Green 染色10 min，結(jié)束后，清水沖洗1次，而后在凝膠成像儀下成像。

1.2.6 糖耗分析 按時間點取發(fā)酵液1 mL，經(jīng)高速離心（10 000 r·min-1，10 min）后，取出上清液過0.22 μm 濾膜，利用高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）測定發(fā)酵液中糖含量。檢測器為 Waters 2414示差檢測器；分離柱為Aminex HPX-87H 柱 （Bio-Rad，Hercules，CA，USA）；檢測溫度45 ℃ ；流速0.5 mL·min-1；流動相為5 mmol·L-1 H2SO4。

1.2.7 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

①RNA提取：將嗜熱毀絲霉成熟孢子接種于2%葡萄糖培養(yǎng)基中，孢子終水平為106個·mL-1，于45 ℃ 150 r·min-1培養(yǎng)18 h，而后收集菌絲并用滅菌水洗滌3 次（40 mL·次-1）；將菌絲轉(zhuǎn)移至2%木糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo) 4 h，而后利用布氏漏斗收集菌絲，置于-80 ℃冰箱保存。利用液氮預(yù)冷的研缽，將樣品磨至粉末，而后按照RNA純化回收試劑盒和文獻[27]方法提取純化RNA。

②轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析：將檢測合格的RNA[OD260/OD280 gt; 1.8，RIN （RNA integrity number）gt;7.0]送至由諾禾致源公司（天津），利用IlluminaHiSeqTM 2000平臺進行測序，每個樣本2個平行，根據(jù)文獻[34]方法處理和分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子XlnR 在嗜熱毀絲霉木糖利用中的功能分析

轉(zhuǎn)錄激活因子XlnR及同源蛋白具有調(diào)控半纖維素酶基因表達及木糖利用的功能[20]。為了研究XlnR （Mycth_2310145） 在嗜熱毀絲霉木糖利用中的調(diào)控作用，利用CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)[31]構(gòu)建了嗜熱毀絲霉突變體ΔxlnR。對突變體ΔxlnR 在木糖、阿拉伯糖及葡萄糖液體培養(yǎng)基中的糖利用速率進行檢測，結(jié)果（圖1）顯示，敲除xlnR 后，嗜熱毀絲霉喪失了木糖利用能力（圖1A）。阿拉伯糖與木糖同為五碳糖，二者均是半纖維素的主要構(gòu)成單元，且具有相似的代謝途徑。糖消耗試驗顯示，突變體ΔxlnR 的阿拉伯糖利用能力與野生型（WT）菌種相比顯著下降（圖1B）；而葡萄糖的消耗速率上升（圖1C）。突變體ΔxlnR 對木二糖和木三糖的利用能力與木糖消耗相似，xlnR 失活后，嗜熱毀絲霉喪失了在木二糖和木三糖上生長的能力（圖1D）；同時，突變體ΔxlnR 在木糖固體平板上生長狀況顯著弱于野生型（圖1E）。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子XlnR在嗜熱毀絲霉木糖代謝中起激活作用。

將絲狀真菌孢子接種至液體培養(yǎng)基中后，首先是孢子的萌發(fā)，而后菌絲體生長。xlnR 的敲除可能影響了嗜熱毀絲霉孢子在木糖條件下的萌發(fā)，進而導(dǎo)致突變體喪失木糖利用能力。為了驗證這一推斷，將野生型嗜熱毀絲霉和突變體ΔxlnR 在葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h 后轉(zhuǎn)接到木糖液體培養(yǎng)基中，測定木糖利用速率。結(jié)果（圖2）顯示，突變體ΔxlnR 菌絲仍然具備木糖利用的能力，但其糖耗速率顯著低于野生型菌株，說明XlnR不僅參與調(diào)控木糖代謝，而且對嗜熱毀絲霉孢子在木糖條件下萌發(fā)具有重要作用。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子Cre-1 在嗜熱毀絲霉木糖代謝中的功能分析

在絲狀真菌中，Cre-1是介導(dǎo)碳源降解物代謝阻遏的主要調(diào)控因子，參與調(diào)控轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、糖分解代謝相關(guān)因子、纖維素酶以及半纖維素酶基因的表達[17]。在嗜熱毀絲霉中，利用RNAi技術(shù)抑制cre-1 的表達后，纖維素酶及半纖維素酶基因的表達水平顯著提高[31]。為了研究Cre-1在嗜熱毀絲霉木糖代謝中的調(diào)控功能，利用基因組編輯技術(shù)構(gòu)建了突變體Δcre-1，并檢測突變體木糖利用速率。結(jié)果（圖3）顯示，敲除cre-1 后，嗜熱毀絲霉的木糖利用速率顯著提升，與野生型菌株相比，突變體Δcre-1 的木糖利用速率提升25%。相似的是，在葡萄糖培養(yǎng)基中，突變體Δcre-1 的糖耗速率較野生型提升33%。由此表明，轉(zhuǎn)錄因子Cre-1參與調(diào)控嗜熱毀絲霉中葡萄糖和木糖的利用，是葡萄糖和木糖代謝途徑的抑制因子。

2.3 在木糖條件下突變體ΔxlnR 和Δcre-1 的轉(zhuǎn)錄組分析

在絲狀真菌中，木糖在木糖還原酶 （xylosereductase，XR） 和木糖醇脫氫酶（xylitoldehydrogenase，XDH） 催化作用下形成木酮糖；在木酮糖激酶 （xylulokinase，XKS） 的作用下，形成5-磷酸木酮糖，然后進入戊糖磷酸途徑 （pentosephosphate pathway，PPP） 非氧化階段。為探究轉(zhuǎn)錄因子XlnR 和Cre-1 調(diào)控木糖代謝的分子機制，系統(tǒng)分析了嗜熱毀絲霉在木糖條件下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果（圖4A）表明，突變體ΔxlnR 中xr 和xdh的表達水平與野生型菌株相似，但木酮糖激酶基因xks 和磷酸戊糖途徑非氧化階段相關(guān)基因（rki、rpe、tkl 和tal）在突變體中的表達水平顯著低于野生型菌株，暗示XlnR可能通過調(diào)控木酮糖激酶基因表達以及PPP途徑來調(diào)節(jié)木糖代謝。在突變體Δcre-1 中，木糖代謝途徑及PPP途徑相關(guān)基因的表達水平顯著高于野生型，這與突變體Δcre-1 顯著提升的木糖利用速率一致。

糖轉(zhuǎn)運是胞內(nèi)糖代謝的前提，在木糖誘導(dǎo)條件下，嗜熱毀絲霉中有3 個木糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（Mycth_2308157、Mycth_96047 和Mycth_112491）被高效誘導(dǎo)表達，其中，Mycth_96047在粗糙脈孢菌中的同源蛋白NCU06138 為高效木糖轉(zhuǎn)運蛋白[35]。敲除xlnR 后，Mycth_96047在嗜熱毀絲霉中的表達水平下降約10倍，與突變體ΔxlnR 變?nèi)醯哪咎谴x一致。另外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖4B）表明，在突變體Δcre-1 中，11個糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達水平相比野生型菌株WT顯著提高，其中11個基因的表達水平上調(diào)超過10倍。前期研究表明，粗糙脈孢菌中的Cre-1可以通過抑制糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達，進而調(diào)控胞內(nèi)糖代謝[36]。

木糖作為半纖維素構(gòu)成單元，具有誘導(dǎo)木聚糖水解酶基因表達的作用。在木糖條件下，有5個木聚糖水解酶基因（Mycth_112050、Mycth_89603、Mycth_116553、Mycth_80104 和Mycth_39555）被高效誘導(dǎo)表達 （RPKMgt;100）。分析比較不同突變體木聚糖水解酶基因表達，結(jié)果（圖4C）表明，在木糖條件下，突變體ΔxlnR 中木聚糖水解酶基因的表達水平較野生型菌株顯著下調(diào)，說明XlnR在嗜熱毀絲霉中具有調(diào)控半纖維素酶基因表達的功能，這與其同源蛋白在粗糙脈孢菌[21]及里氏木霉[37]中調(diào)控作用相似；與之相反的是，敲除cre-1 后，13個木聚糖水解酶基因的表達水平顯著上調(diào)，表明Cre-1具有抑制嗜熱毀絲霉半纖維素酶基因表達的功能。

2.4 木糖利用阻遏因子Cre-1 直接抑制轉(zhuǎn)錄激活因子XlnR 的表達

為了研究木糖利用調(diào)控因子Cre-1 與XlnR的之間的調(diào)控關(guān)系，將融合純化標(biāo)簽GST 的蛋白Cre-1-GST 和XlnR-GST 在E. coli BL21 （DE3） 中表達，結(jié)果（圖5A）顯示，Cre-1可直接與xlnR 啟動子區(qū)域結(jié)合，而XlnR則不能結(jié)合于cre-1 啟動子區(qū)域。另外，比較木糖條件下嗜熱毀絲霉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖5B）發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，突變體Δcre-1 中xlnR 基因 的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)3倍。在嗜熱毀絲霉中Cre-1能夠直接抑制調(diào)控激活因子基因xlnR 的表達（圖5C）。

2.5 嗜熱毀絲霉木糖代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)

為了提升嗜熱毀絲霉木糖代謝速率，將轉(zhuǎn)錄激活因子基因xlnR 在野生型嗜熱毀絲霉中過表達，過表達突變體菌株OE_xlnR 的木糖利用速率較野生型菌株提高14.2%，完全消耗20 g·L-1木糖所需時間由96 h 降至 84 h（圖6），進一步說明轉(zhuǎn)錄因子XlnR對木糖代謝具有激活作用。

為了進一步強化木糖代謝速率，敲除突變體OE_xlnR 中基因cre-1，以實現(xiàn)木糖代謝的解阻遏，獲得突變體OE_xlnRΔcre-1。在木糖液體培養(yǎng)基中，突變體OE_xlnRΔcre-1 木糖消耗速率較對照菌株OE_xlnR 提升75%，較野生型菌種提升100%，消耗20 g·L-1 木糖所需時間縮短至48 h（圖6）。

3 討論

絲狀真菌是目前國內(nèi)外纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)的主要體系，同時也是眾多關(guān)鍵工業(yè)化學(xué)品的重要生產(chǎn)者[7]。實現(xiàn)絲狀真菌高效利用生物質(zhì)糖是降低生物質(zhì)煉制經(jīng)濟成本的關(guān)鍵之一。木糖是生物質(zhì)中半纖維素的重要組成部分，但由于碳代謝物阻遏效應(yīng)的存在，木糖在絲狀真菌中的代謝往往受到嚴(yán)重的抑制。嗜熱毀絲霉為高效的纖維素降解菌種，同時能夠高效利用六碳糖和五碳糖，目前已被開發(fā)為工業(yè)纖維素酶和化學(xué)品細胞工廠[38]。本研究以嗜熱毀絲霉為體系，利用遺傳學(xué)手段及轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了其木糖代謝調(diào)控機制，并結(jié)合基因組編輯技術(shù)對其進行了改造，顯著提升了嗜熱毀絲霉的木糖代謝速率。

在木霉和曲霉中，轉(zhuǎn)錄因子XlnR及其同源蛋白是纖維素酶和半纖維素酶基因的主要激活因子， XlnR的失活將導(dǎo)致纖維素不能誘導(dǎo)纖維素酶和半纖維素酶基因的表達[18- 19，25]。而在粗糙脈孢菌中，XlnR 僅調(diào)控半纖維素酶基因的表達，是半纖維素利用相關(guān)基因表達所必需的[35]。此外，在曲霉和木霉中，XlnR具有調(diào)控木糖代謝的功能，參與調(diào)控木糖還原酶基因的表達，敲除xlnR 后將大幅降低突變體利用木糖和木聚糖的能力[15]。本研究利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建絲狀真菌嗜熱毀絲霉突變體ΔxlnR，表型分析發(fā)現(xiàn)，突變體ΔxlnR 的阿拉伯糖利用能力顯著下降，但葡萄糖利用能力顯著提升；而在木糖條件下，突變體ΔxlnR 的孢子喪失了萌發(fā)能力，且菌絲木糖的利用速率顯著降低，過表達xlnR 使得木糖利用速率提升14.2%；分析突變體ΔxlnR 在木糖條件下的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，敲除xlnR 導(dǎo)致木聚糖水解酶基因、木糖轉(zhuǎn)運蛋白基因以及磷酸戊糖途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，說明在嗜熱毀絲霉中XlnR參與調(diào)控菌絲木糖代謝和半纖維素酶誘導(dǎo)，同時，對木糖條件下孢子萌發(fā)具有重要作用。

在絲狀真菌中，全局調(diào)控因子Cre-1 屬于Cys2His2 型鋅指家族，是釀酒酵母中Mig1的同源蛋白[14，39]。Cre-1 作為重要碳源代謝阻遏調(diào)控因子，在絲狀真菌生長、碳代謝及纖維素水解酶的表達中起重要調(diào)控作用[17]。在粗糙脈孢菌及里氏木霉中，敲除cre-1 能顯著提升纖維素酶和半纖維素酶的表達[16]。本研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，Cre-1的失活導(dǎo)致突變體Δcre-1 中木聚糖水解酶基因的表達水平顯著上調(diào)，暗示Cre-1對嗜熱毀絲霉半纖維素酶表達有抑制作用；同時，突變體Δcre-1 木糖消耗速率顯著提高以及木糖代謝和轉(zhuǎn)運蛋白基因高效表達，暗示Cre-1抑制嗜熱毀絲霉木糖代謝。EMSA分析表明，Cre-1能夠直接結(jié)合xlnR 啟動子區(qū)域，結(jié)合xlnR 在突變體Δcre-1 中表達水平下調(diào)，證明Cre-1能夠直接抑制xlnR 的表達；另外Cre-1能夠結(jié)合至其自身編碼基因啟動子區(qū)域，暗示Cre-1具有自我調(diào)控的功能。研究表明，在葡萄糖條件下，里氏木霉Cre-1的表達能被自身負調(diào)控[16]。這也解釋了嗜熱毀絲霉突變體Δcre-1 具有較高葡萄糖利用能力的原因。

通過代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)可以有效地改善發(fā)酵菌株的碳源利用速率。本研究利用基因組編輯技術(shù)過表達木糖代謝激活因子XlnR編碼基因，同時敲除抑制因子Cre-1編碼基因，顯著提升了嗜熱毀絲霉木糖代謝速率，為改善發(fā)酵菌株木糖利用速率、提升生物質(zhì)全糖利用提供了新思路。

參考文獻

［1］ TAKKELLAPATI S， LI T， GONZALEZ M A. An overview of biorefinery derived platform chemicals from a cellulose and hemicellulose biorefinery [J]. Clean Technol. Environ. Policy，2018， 20（7）：1615-1630.

［2］ ALI S S， NUGENT B， MULLINS E， et al .. Fungal-mediated consolidated bioprocessing： the potential of Fusarium oxysporum for the lignocellulosic ethanol industry [J/OL]. AMB Express， 2016， 6（1）：13 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1186/s13568-016-0185-0.

［3］ ZNAMEROSKI E A， CORADETTI S T， ROCHE C M， et al .. Induction of lignocellulose-degrading enzymes in Neurospora crassa by cellodextrins [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2012，109（16）：6012-6017.

［4］ BALAT M. Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway： a review [J]. Energy Convers. Manage.， 2011， 52（2）：858-875.

［5］ VITIKAINEN M， ARVAS M， PAKULA T， et al .. Array comparative genomic hybridization analysis of Trichoderma reesei strains with enhanced cellulase production properties [J/OL].BMC Genomics， 2010， 11（1）：441 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1186/1471-2164-11-441.

［6］ ALI S S， NUGENT B， MULLINS E， et al .. Insights from the fungus Fusarium oxysporum point to high affinity glucose transporters as targets for enhancing ethanol production from lignocellulose [J/OL]. PLoS One， 2013， 8（1）：e54701 [2023-02-10]. https：//doi.org/ 10.1371/journal.pone.0054701.

［7］ LIU G， QU Y. Engineering of filamentous fungi for efficient conversion of lignocellulose： tools， recent advances and prospects [J]. Biotechnol. Adv.， 2019， 37（4）：519-529.

［8］ VISSER H， JOOSTEN V， PUNTPETER J， et al .. Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate， previously known as Chrysosporium lucknowense C1 [J].Ind. Biotechnol.， 2011， 7：214-223.

［9］ DRUZHININA I S， KUBICEK C P. Genetic engineering of Trichoderma reesei cellulases and their production [J]. Microb.Biotechnol.， 2017， 10（6）：1485-1499.

［10］ LI N， LIU Y， LIU D， et al .. MtTRC-1， a novel transcription factor， regulates cellulase production via directly modulating the genes expression of the Mthac-1 and Mtcbh-1 in Myceliophthora thermophila [J/OL]. Appl. Environ. Microbiol.，2022， 88（19）：e0126322 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1128/aem.01263-22.

［11］ HECTOR R E， QURESHI N， RHUGHES S， et al .. Expression of a heterologous xylose transporter in a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to utilize xylose improves aerobic xylose consumption [J]. Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2008， 80（4）：675-684.

［12］ WU V W， THIEME N， HUBERMAN L B， et al .. The regulatory and transcriptional landscape associated with carbon utilization in a filamentous fungus [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2020， 117（11）：6003-6013.

［13］ DENG H， BAI Y， FAN T P， et al .. Advanced strategy for metabolite exploration in filamentous fungi [J]. Crit. Rev.Biotechnol.， 2020， 40（2）：180-198.

［14］ ADNAN M， ZHENG W， ISLAM W， et al .. Carbon catabolite repression in filamentous fungi [J/OL]. Int. J. Mol. Sci.， 2017，19（1）：48 [2023-02-10]. https：//doi.org/ 10.3390/ijms19010048.

［15］ TAMAYO E N， VILLANUEVA A， HASPER A A， et al .. CreA mediates repression of the regulatory gene xlnR which controls the production of xylanolytic enzymes in Aspergillus nidulans[J]. Fungal Genet. Biol.， 2008， 45（6）：984-993.

［16］ ANTONIETO A C， DOS SANTOS CASTRO L， SILVAROCHAR， et al .. Defining the genome-wide role of CRE1 during carbon catabolite repression in Trichoderma reesei using RNA-Seq analysis [J]. Fungal Genet. Biol.， 2014， 73：93-103.

［17］ PORTNOY T， MARGEOT A， LINKE R， et al .. The CRE1 carbon catabolite repressor of the fungus Trichoderma reesei： a master regulator of carbon assimilation [J/OL]. BMC Genomics，2011， 12：269 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1186/1471-2164-12-269.

［18］ FURUKAWA T， SHIDA Y， KITAGAMI N， et al .. Identification of specific binding sites for XYR1， a transcriptional activator of cellulolytic and xylanolytic genes in Trichoderma reesei [J].Fungal Genet. Biol.， 2009， 46（8）：564-574.

［19］ PORTNOY T， MARGEOT A， SEIDL-SEIBOTH V， et al .. Differential regulation of the cellulase transcription factors XYR1， ACE2， and ACE1 in Trichoderma reesei strains producing high and low levels of cellulase [J]. Eukaryot. Cell，2011， 10（2）：262-271.

［20］ DOS SANTOS GOMES A C， FALKOSKI D， BATTAGLIA E， et al .. Myceliophthora thermophila Xyr1 is predominantly involved in xylan degradation and xylose catabolism [J/OL].Biotechnol. Biofuels， 2019， 12： 220 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1186/s13068-019-1556-y.

［21］ CRAIG J P， CORADETTI S T， STARR T L， et al .. Direct target network of the Neurospora crassa plant cell wall deconstruction regulators CLR-1， CLR-2， and XLR-1 [J/OL]. Mbio， 2015， 6（5）：e01452-15 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1128/mBio.01452-15.

［22］ HASPER A A， TRINDADE L M， VAN DER VEEN D， et al .. Functional analysis of the transcriptional activator XlnR from Aspergillus niger [J]. Microbiology， 2004， 150（Pt5）：1367-1375.

［23］ HASPER A A， VISSER J， DE GRAAFF L H. The Aspergillus niger transcriptional activator XlnR， which is involved in the degradation of the polysaccharides xylan and cellulose， also regulates d-xylose reductase gene expression [J]. Mol. Microbiol.，2000， 36（1）：193-200.

［24］ MACH-AIGNER R， PUCHER E， STEIGER G， et al.. Transcriptional regulation of xyr1， encoding the main regulator of the xylanolytic and cellulolytic enzyme system in Hypocrea jecorina [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2008，74（21）：6554-6562.

［25］ MACH-AIGNER A R， OMONY J， JOVANOVIC B， et al ..D-Xylose concentration-dependent hydrolase expression profiles and the function of CreA and XlnR in Aspergillus niger [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2012， 78（9）：3145-3155.

［26］ BERKA R M， GRIGORIEV I V， OTILLAR R， et al ..Comparative genomic analysis of the thermophilic biomassdegrading fungi Myceliophthora thermophila and Thielaviaterrestris [J]. Nat. Biotechnol.， 2011， 29（10）：922-927.

［27］ XU J， LI J， LIN L， et al .. Development of genetic tools for Myceliophthora thermophila [J/OL]. BMC Biotechnol.， 2015， 15：35 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1186/s12896-015-0165-5.

［28］ SONG R， ZHAI Q， SUN L， et al .. CRISPR/Cas9 genome editing technology in filamentous fungi： progress and perspective [J].Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2019， 103（17）：6919-6932.

［29］ SWIAT M A， DASHKO S， DEN RIDDER M， et al .. FnCpf1：a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae [J]. Nucleic Acids Res.， 2017， 45（21）：12585-12598.

［30］ PATEL H， RAWAT S. Thermophilic fungi： diversity， physiology， genetics， and applications [J]. New Future Dev.Microb. Biotechnol. Bioeng.， 2021， 13（6）：69-93.

［31］ LIU Q， GAO R， LI J， et al .. Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering [J/OL]. Biotechnol. Biofuels， 2017， 10：1 [2023-02-10]. https：//doi.org/ 10.1186/s13068-016-0693-9.

［32］ LI J， GU S， ZHAO Z， et al .. Dissecting cellobiose metabolic pathway and its application in biorefinery through consolidated bioprocessing in Myceliophthora thermophila [J/OL]. Fungal Biol. Biotechnol.， 2019， 6： 21 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1186/s40694-019-0083-8.

［33］ XU Q， SINGH A， HIMMEL M E. Perspectives and new directions for the production of bioethanol using consolidated bioprocessing of lignocellulose [J]. Curr. Opin. Biotechnol.，2009， 20（3）：364-371.

［34］ WANG B， LI J， GAO J， et al .. Identification and characterization of the glucose dual-affinity transport system in Neurospora crassa： pleiotropic roles in nutrient transport， signaling， and carbon catabolite repression [J/OL]. Biotechnol.Biofuels， 2017， 10： 17 [2023-02-10]. https：//doi. org/10.1186/s13068-017-0705-4.

［35］ SUN J， TIAN C， DIAMOND S， et al .. Deciphering transcriptional regulatory mechanisms associated with hemicellulose degradation in Neurospora crassa [J]. Eukaryot.Cell， 2012， 11（4）：482-493.

［36］ SUN J， GLASS N L. Identification of the CRE-1 cellulolytic regulon in Neurospora crassa [J/OL]. PLoS One， 2011， 6（9）：e25654 [2023-02-10]. https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0025654.

［37］ FURUKAWA T， SHIDA Y， KITAGAMI N， et al .. Identification of specific binding sites for XYR1， a transcriptional activator of cellulolytic and xylanolytic genes in Trichoderma reesei [J].Fungal Genet. Biol.， 2009， 46（8）：564-574.

［38］ LI J， LIN L， SUN T， et al .. Direct production of commodity chemicals from lignocellulose using Myceliophthora thermophila [J].Metab. Eng.， 2020， 61：416-426.

［39］ WEINHANDL K， WINKLER M， GLIEDER A， et al .. Carbon source dependent promoters in yeasts [J/OL]. Microb. Cell Fact.， 2014， 13： 5[2023-02-10]. https：//doi.org/10.1186/1475-2859-13-5.